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天然CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)对于维持适度的免疫耐受和免疫稳态至关重要。CD4+CD25+ Treg细胞结构性表达叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4。上述关键的免疫调节性分子缺陷时，小鼠表现为致死性淋巴细胞增殖表型。CD4+CD25+Treg表达Toll样受体4(TLR4)，后者可以被脂多糖(LPS)激活，Treg细胞抑制活性随之增强。Treg细胞还可以分泌抑制性细胞因子，如转化生长因子(TGF)-β和白细胞介素(IL)-10，发挥免疫抑制效应，抑制效应T细胞。Treg细胞自身增殖活性低下，它在体外可以抑制IL-2的产生，进而抑制T细胞活化。Treg细胞还可以通过细胞表面的IL-2受体，消耗效应T细胞赖以生存的IL-2，进而导致效应T细胞凋亡。Treg细胞可以控制Th1和Th2细胞转录因子表达，进而控制Th1和Th2型免疫反应。Treg细胞对于控制脓毒症早期的炎症反应有利。但是Treg细胞增多可以导致淋巴细胞增殖受抑制，进而导致脓毒症免疫麻痹。 IL-37(IL-1F7)在人类细胞表达，在小鼠中不表达。但是人重组IL-37对小鼠细胞的效应和人类细胞的效应相似，均表现为下调固有免疫和获得性免疫反应。体内研究显示，IL-37在多种炎症疾病中发挥抗炎效应。IL-37转基因小鼠研究显示，IL-37对内毒素血症、刀豆素A诱导的肝炎、葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎、缺血再灌注损伤均有抗炎保护效应。新近研究显示，IL-37在人Treg细胞表达，基因敲减IL-37可以减弱Treg细胞的抑制活性。 研究目的： 1.研究IL-37对正常小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响; 2.体外模拟脓毒症环境，研究IL-37对LPS环境中小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响; 3.研究IL-37对脓毒症小鼠的生存保护效应。 研究方法： 1.按照说明书要求，用美天妮磁性分离仪从C57BL/6J小鼠脾脏细胞中分选CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞。流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg纯度; 2.用重组人IL-37(rhIL-37)(0～250ng/ml)刺激Treg细胞12～48h。收集细胞上清液，EHSA分析Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1变化;部分预处理的Treg细胞，进行免疫荧光染色，流式细胞术分析Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达变化;部分预处理的Treg细胞用于抑制活性分析。IL-37预处理的Treg细胞与CFSE标记的CD4+CD25-T细胞共培养，96小时后收集上清液，ELISA检测CD4+CD25-T细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ浓度。同时收集细胞，上流式细胞仪检测CFSE稀释度，检测发生CFSE稀释的CD4+CD25-T细胞百分比，借此分析CD4+CD25-T淋巴细胞增殖程度。通过检测上述指标，分析IL-37刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的关系， 3.LPS(5μg/ml)预处理Treg细胞3天，预处理结束前24h向培养基中加入不同浓度IL-37(0～250ng/ml)。预处理完毕后分析Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达，IL-10/TGF-β分泌;Treg/CD4+CD25-T共培养，收集细胞上流式细胞仪，检测Treg对效应T细胞增殖活性的抑制程度;收集共培养上清液，检测IL-2、IL-4和IFN-γ分泌。通过分析上述指标，明确LPS环境中，IL-37能否影响Treg细胞免疫抑制活性。 4.建立小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型，假手术组只分离盲肠，但不予结扎穿刺。给小鼠腹腔注射IL-37（1μg）。IL-37腹腔注射分三种方式:CLP术前2h注射、CLP术后立即注射和CLP术后2h注射。在三个相应时间点腹腔注射PBS(200μl)作为对照组处理方式。处理完毕后，观察CLP小鼠8天生存率。 5.统计学分析:应用SPSS软件统计分析。连续性变量首先进行正态性检验和方差齐性检验。数据用均数±标准差(SD)表示。每个实验重复三次。多组比较应用单因素方差分析和Bonferroni检验。生存率应用Kaplan-Meier生存曲线分析和log rank检验。P＜0.05认为有统计学差异。 研究结果： 1.IL-37对CD4+CD25+Treg抑制活性的影响:IL-37预处理增强了CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞的免疫抑制活性，100 ng/ml处理组和24h处理组效应最明显。LPS可以活化小鼠Treg细胞，加强Treg细胞免疫抑制活性。IL-37预处理，可以进一步上调LPS环境中的Treg细胞的免疫抑制活性。 2.IL-37对Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达的影响:IL-37(40～250ng/ml)预处理Treg细胞24h，可以显著增强Foxp3表达;IL-37(100～250ng/ml)预处理Treg细胞24h，可以显著增强CTLA-4表达。100 ng/mlIL-37预处理Treg细胞不同时间，24h组Treg细胞的Foxp3/CTLA-4表达上调最明显。LPS刺激上调Foxp3表达，但是对CTLA-4表达无影响。IL-37联合LPS刺激，可以上调Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达。 3.IL-37对Treg细胞IL-10/TGF-β分泌的影响:IL-37促进Treg细胞分泌TGF-β1。LPS刺激也可以加强TGF-β1分泌。LPS环境中，IL-37刺激可以进一步促进Treg细胞分泌TGF-β。IL-37和LPS单独刺激，或IL-37/LPS联合刺激，对Treg细胞IL-10分泌均无影响。 4.IL-37对共培养试验中CD4+CD25-T细胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的影响:Treg细胞可以抑制IL-2，但是IL-37预处理不影响Treg对IL-2的抑制效应。LPS预处理加强Treg细胞对IL-2的抑制效应，LPS联合IL-37刺激，不能进一步上调Treg细胞对IL-2的抑制效应。Treg细胞有效诱导Th2细胞极化，共培养试验中上清液IL-4/IFN-γ比例增加，提示Th2细胞增多。IL-37刺激或IL-37联合LPS刺激，加强了Treg细胞极化Th2细胞的效应。 5.IL-37对脓毒症动物生存率的影响:IL-37预处理或IL-37术后立即给药，均可以改善动物生存率。然而，IL-37术后2h给药对脓毒症动物没有生存保护效应。 研究结论： rhIL-37增强CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制活性，这为脓毒症免疫调节治疗提供了新思路。