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禽流感是由A型流感病毒引起的鸟类感染性疾病,其中高致病性H5N1禽流感病毒可以在动物和人类中相互感染,且病死率极高。疫苗是预防禽流感的最主要的方法,而传统的禽流感疫苗的生产方式难以满足疫情爆发时的需求。我们首次应用家蚕杆状病毒表面展示技术高效表达禽流感病毒HA基因。首先利用杆状病毒载体pFastBacHTb作为转座载体,将gp64-HA基因转座到杆状病毒基因组(Bacmid)上,构建Bacmid-gp64-HA。然后通过脂质体将Bacmid-gp64-HA转染家蚕BmN细胞得到重组病毒vBmgp64-HA。以扩增后的重组病毒感染家蚕细胞,收集发病细胞,Western blotting和PCR分析结合血凝试验表明,gp64-HA基因在家蚕细胞中成功表达。可大规模获得重组杆状病毒,每头蚕蛹产量最高可达1 mg,这为研究并优化疫苗的生产工艺,生产出质量稳定可控的禽流感疫苗提供了保障。我们最初采用低速离心、高速离心、超速离心、区带离心分离纯化带囊膜的病毒,半成品比活达到206 u/mg,活性成分回收率为6.8%,但是对其进行SDS-PAGE和Western-Blotting时并没有发现相应的目的条带,分析实验结果发现,蚕蛹高达30%的油脂严重影响了病毒的分离效果,并造成了血凝试验的假阳性。我们采用30%饱和度硫酸铵溶液沉淀杂蛋白,并用60%饱和度硫酸铵溶液沉积病毒粒子代替超速离心,两者结合有效地使目的产物和油脂相分离,其中60%饱和度硫酸铵溶液沉积病毒粒子一步活性回收率高达88.9%,而且在改进生产工艺后,样品在SDS-PAGE和Western-Blotting分析时也出现了明显的目的条带,该工艺生产的半成品血凝滴度可以达到1:28,但是其蛋白浓度也达到了103 mg/mL,过多的杂蛋白导致超滤缓慢,过滤除菌也因样品透不过0.22μm膜而失败;为去除过多的杂蛋白,新工艺加入了对低速离心得到的上清经过10μm、0.45μm滤芯抽滤,再用两次区带离心代替一次区带离心的方法,最后的半成品采用透析脱糖的方法代替超滤脱糖,其中两次区带离心对病毒的分离和浓缩起到了很好的效果,其比活从第一次区带离心的34 u/mg提高到100 u/mg,而且第二次区带离心后回收的半成品的血凝滴度达到了1:24,其蛋白浓度只有3.2 mg/mL,比活可以达到100 u/mg,改进后的工艺,纯化明显,批次制备的样品质量稳定,为禽流感疫苗的大批量生产提供了可靠的依据。