第一章不同热剂量热疗对小鼠黑色素瘤细胞HSP70表达的影响目的:热疗可以增强肿瘤细胞的免疫原性以制备肿瘤疫苗,且这种免疫原性的增强与HSP70的诱导表达相关。然而不同温度的热诱导对细胞表面抗原的影响不同,且这种影响在很大程度上取决于肿瘤的类型、动物模型(小鼠或者大鼠)、热剂量以及热作用后恢复的时间。为了获得增强小鼠黑色素瘤B16细胞免疫原性的最适温度,本实验比较了不同热剂量热疗对B16细胞HSP70表达和转录的影响,为下一步制备小鼠黑色素瘤疫苗提供了实验基础和依据。方法:体外培养B16细胞至对数生长期,将培养瓶密封浸没于恒温水浴槽内以42℃60min,45℃15min以及50℃5min热疗。热疗后予以换液并放回37℃细胞培养箱进行复温孵育,分别于复温孵育2h,12h,24h,48h后收集细胞的总RNA和总蛋白,采用RT-PCR法和Western blot法从基因转录和蛋白表达水平检测不同温度热疗后HSP70的表达情况以探讨B16细胞免疫原性与热剂量(42-50℃温度范围)及复温孵育时间的相关性。结果:Western blot结果显示与37℃对照组相比,热疗各组均能诱导HSP70明显表达(p<0.05)。但各组表达高峰时间点不一致。42℃组在2h时达表达高峰,随后逐渐下降;45℃组则在2h时表达尚无明显表达增高,随后逐渐升高,至24h达高峰后开始下降,且该高峰表达量与42℃高峰相比增高更显著(p<0.01);50℃组表达量亦随孵育时间逐渐升高并在24h时达高峰,但升高程度明显低于42℃和45℃组(p<0.01)。RT-PCR结果与Western Blot相似:热疗后各组HSP70基因转录增加,45℃24h的转录水平高于42℃2h的转录水平(p<0.05)。结论:本实验通过比较42℃,45℃以及50℃热疗对小鼠黑色素瘤细胞B16 HSP70表达的影响,提示45℃15min热疗可能是制备富含HSP70细胞瘤苗的理想热剂量,为下一步制备肿瘤疫苗的热剂量选择提供了依据。第二章热处理肿瘤细胞裂解物联合免疫佐剂CpG-ODN诱导特异性抗肿瘤免疫反应的实验研究目的:越来越多的证据表明热疗及其相关的热休克反应可以增加肿瘤细胞的免疫原性,能启动并促进免疫,因而有可能是制备和改良肿瘤疫苗的途径之一。这种热处理瘤苗(高温固化瘤苗、热休克诱导后细胞的裂解产物等)如应用于小鼠体内,无论是预防接种还是治疗荷瘤,均显示出了一定的抗肿瘤效应。但由于肿瘤细胞存在各种逃逸机制,单一瘤苗的疗效常不理想。CpG寡聚核苷酸(CpG ODN)具有提高蛋白抗原和DNA疫苗的免疫原性,可作为多种抗原的免疫佐剂而发挥独特的免疫增强作用,在粘膜免疫、提高新生动物免疫力和抗肿瘤等方面都显示出巨大的潜力。基于以上观点,本研究以小鼠黑色瘤为模型探索利用45℃热诱导后B16细胞裂解物作为瘤苗,联合新型免疫佐剂CpG-ODN免疫小鼠,观察其诱导的小鼠抗肿瘤免疫保护作用及其对小鼠免疫系统功能的影响。方法:48只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组12只:PBS对照组(PBS)、45℃热处理肿瘤细胞裂解产物治疗组(Heated celllysates,HCL)、CpG-ODN2395治疗组(CpG)和CpG-ODN2395+45℃热处理肿瘤细胞裂解产物联合治疗组(CpG+HCL),并于第0、6、12、18、24天将四种疫苗:PBS、HCL(2×10~7个细胞裂解产物/0.2ml/只)、CpG-ODN2395(30μg/0.2ml/只)和HCL+CpG({HCL(2×10~7)+CpG(30μg)}/0.2ml/只)分四点分别注射至各组小鼠双侧腋窝、双侧腹股沟皮下,0.05mL/注射点,共0.2mL/只。每隔5天一次,共接种5次。第30天每组随机抽取3只小鼠,收集小鼠脾细胞和外周血检测小鼠脾细胞特异性增殖、CTL细胞细胞毒活性、Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)的分泌活性以及小鼠外周血T细胞亚群CD4~+、CD8~+的比值,及CD4~+CD25~+调节性T细胞亚群百分比。另于第30天以1×10~5个活性B16细胞对剩余小鼠进行肿瘤攻击,观察各组小鼠的出瘤率、出瘤时间,肿瘤生长状态以及生存期以评估肿瘤疫苗对小鼠恶性黑色素瘤的保护性免疫作用。结果:与PBS相比,CpG-ODN2395,HCL以及联合疫苗(HCL+CpG-ODN)均可明显抑制小鼠肿瘤生长(p<0.05),并使生存期延长。其中以联合疫苗组疗效最显著,它使35%的小鼠获得抵抗致死剂量同源肿瘤细胞攻击的保护性免疫力。即使未能抵抗住肿瘤攻击而长出肿瘤的小鼠,其无论出瘤时间、生存期或肿瘤体积与CpG-ODN组、HCL组相比均有显著性差异(p<0.01)。联合瘤苗可以明显改善机体免疫系统功能状态,逆转外周血T细胞亚群CD4~+、CD8~+的比值,诱导Th1型细胞因子(IFN-γ,IL-2)的分泌,增强小鼠脾淋巴细胞特异性增殖以及CTL细胞的特异性细胞毒活性。CpG-ODN和HCL虽也可在一定程度上诱导上述免疫反应,但是活性明显低于联合免疫组,尤以HCL组最弱,且其诱导IL-2的分泌、以及特异性细胞增殖、CTL细胞毒反应的活性与对照组相比没有统计学差异。另外,外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞亚群比例在实验各组均未观察到明显差异。结论:联合应用新型免疫佐剂CpG-ODN和热处理后富含HSP70的肿瘤细胞裂解物可显著改善机体免疫系统状态,激发机体抗肿瘤免疫反应,使部分小鼠获得能抵抗致死剂量肿瘤细胞攻击的保护性免疫,或者显著抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期。其可能机制为:一方面HCL中携带有多种肿瘤特异或者相关抗原的HSP-抗原肽复合物能活化多克隆的肿瘤特异性淋巴细胞;另一方面,HCL在免疫活性物质CpG-ODN的协同作用下,通过调节多种细胞因子分泌(如Th1型细胞因子IFN-γ,IL-2),改善活性T细胞和抑制性T细胞的分布比例(CD4~+/CD8~+比值),形成较强的免疫活性微环境。活化的肿瘤特异性淋巴细胞在该活性微环境下可进一步得到活化扩展,从而使机体的免疫系统被有效地激活,体现为CTL细胞的特异性细胞毒活性和增殖活性的明显增强。而HCL在激活细胞免疫方面仅表现出较弱的活性。CpG-ODN虽在激活免疫介导细胞免疫上较HCL强,但其免疫活性以及抗肿瘤综合疗效仍明显低于联合疫苗组。第三章局部热疗联合免疫佐剂CpG-ODN治疗小鼠黑色素瘤的疗效及免疫学效应观察目的:局部热疗是指通过不同的致热原理产生局部热效应造成肿瘤细胞凋亡和/或肿瘤组织凝固性坏死而达到杀灭肿瘤的目的。越来越多研究证实,热疗不仅能够对肿瘤细胞起到直接杀伤作用,还可以增加肿瘤细胞的免疫原性并通过原位坏死的肿瘤细胞释放出HSP-抗原肽复合物刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫,这种被称为“原位瘤苗”的现象为肿瘤治疗提供了一个新的视角。但研究表明即使如此,还是有很多残留的肿瘤细胞未能被免疫系统识别、杀灭或控制而复发生长,最终导致治疗失败。CpG-ODNs是一种近年引起广泛关注的水性免疫佐剂,它能增强机体对肿瘤抗原的反应性,诱导比Th1型佐剂的金标准——完全弗氏佐剂更强大的Th1型免疫应答。且其性质是水性无需乳化,人工合成简易廉价,因而制备和给药都非常方便,作为热疗的辅助用药克服了传统佐剂的缺点,应用前景非常广阔。因此,本实验在局部热疗可以改善肿瘤免疫原性的基础上,首次联合CpG-ODNs局部皮下注射治疗小鼠恶性黑色素瘤。利用CpG-ODNs能够活化DC细胞改善抗原提呈的免疫学活性来提高宿主免疫系统对肿瘤细胞的反应性,重建黑色素瘤小鼠细胞免疫的途径,进而激发机体的抗肿瘤细胞免疫,达到控制和治疗恶性黑色素瘤的目的。方法:将同等肿瘤大小的荷瘤C57BL/6小鼠随机分至对照组、热疗组、CpG-ODN组及热疗+CpG-ODN组,每组10只。①对照组(Control组):不予任何治疗;②局部热疗组(RH组):将小鼠麻醉后直接对肿瘤局部进行加热,加热温度50℃～52℃,治疗时间10分钟,加热设备为清华大学和广东工业大学联合研制的加热加湿生物实验平台;③CpG-ODN组:在肿瘤周围分四点皮下注射CpG-ODN2395,共30ug/0.2mL/只;④局部热疗+CpG-ODN组(RH+CpG-ODN组):治疗温度为50℃,时间10分钟,热疗后在肿瘤周围分四点皮下注射CpG-ODN2395,剂量为30ug/0.2mL/只。共热疗及注射CpG-ODN三次,每次间隔3-4天。于末次治疗后14天,从各组中随机抽取3只小鼠收集外周血以检测T细胞亚群比例和收集脾细胞检测其IL-2、IFN-γ的分泌活性。余7只用于观察生存期和动态测量肿瘤体积。结果:经局部热疗和CpG-ODN联合治疗的荷瘤小鼠肿瘤生长明显抑制,呈现一种无进展或缓慢进展状态,且有35%的小鼠肿瘤完全消退。而单一热疗组虽能在热疗时和热疗后短时间使肿瘤明显缩小或生长减慢且对免疫系统有一定程度的激发,但热疗结束后一周内绝大多数小鼠的残余肿瘤再次复发或者开始加速生长,且随着时间推移肿瘤生长速度呈逐渐加快趋势。而单CpG-ODN治疗组小鼠在末次治疗一周后才开始出现肿瘤生长减慢的现象,但尽管速度减慢,肿瘤仍处于不断进展状态最终导致小鼠短期内死亡。进一步的免疫学检测结果显示RH组、CpG-ODN组与RH+CpG-ODN组治疗后小鼠的外周血CD4~+/CD8~+的比值均上升,与对照组相比p<0.001。且联合治疗组升高程度最高,与两个单一治疗组相比有显著统计学差异(p<0.001)。但两个单一治疗组间差异无统计学差异。小鼠脾细胞Th1型细胞因子(IFN-γ和IL-2)的分泌活性在联合治疗和两个单一治疗组亦均明显升高(p<0.05),但升高程度不一,RH组<CpG-ODN组<联合治疗组,各组之间有统计学差异。上述结果提示联合应用CpG-ODN免疫治疗显著提高了局部热疗对小鼠恶性黑色素瘤的疗效并明显改善了机体的免疫功能状态。联合治疗在抑制甚至消除肿瘤,诱导特异性脾细胞增殖,特异性CTL细胞毒作用以及刺激IFN-γ/、IL-2分泌促进Th1型免疫反应等方面都获得了比单一热疗或CpG-ODN免疫治疗更好的疗效。结论:局部热疗是一种有效的肿瘤治疗手段,但由于肿瘤细胞免疫原性极度低下且存在多种逃逸机制,单纯热疗虽能在一定程度上改善杀灭肿瘤和激发抗肿瘤免疫反应,但尚不能有效控制肿瘤。联合应用免疫佐剂如CpG-ODN可弥补单纯热疗的不足,它通过直接或间接活化各种免疫细胞,调节Th1型免疫反应有效地地增强了热疗对机体的抗肿瘤免疫反应尤其是细胞免疫的激发作用,从而显著提高局部热疗的疗效达到消除或控制肿瘤,延长生存期的目的。为热疗临床治疗方案的优化提供了依据。