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微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由淡水蓝藻产生的一类单环七肽类化合物,具有肝肾毒性、神经毒性、胃肠毒性、肺毒性以及雄性生殖毒性。本实验室前期研究率先发现MC-LR(水体中分布最广、毒性最强的一种MCs异构体)同时具有雌性生殖毒性。研究表明,MC-LR进入雌性小鼠体内后,引起小鼠卵巢颗粒细胞(GCs)凋亡,卵泡闭锁加速,各阶段卵泡数量显著减少,动情周期紊乱,小鼠生殖能力下降。GCs凋亡、卵泡闭锁加速是MC-LR造成雌性生殖损伤的核心环节,而GCs的正常功能对卵泡的发育至关重要,因此GCs的损伤将直接影响卵巢的功能。最新研究表明,microRNA(miRNA)可以通过影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路来调节GCs中相关基因的表达。此外,越来越多的证据证明,miRNA在MC-LR诱导的胚胎发育和肿瘤发展中扮演着至关重要的角色。因此,本研究在前期工作的基础上,体外染毒小鼠卵巢颗粒细胞(mGCs),拟通过芯片技术筛选出表达变化的miRNA和mRNA,并通过生物信息学技术分析表达异常的miRNA和mRNA主要参与的信号通路和生物过程,从miRNA角度探讨MC-LR引起mGCs的损伤机制,试图发现其中的分子靶点,作为可利用的分子标记物。第一部分MC-LR对mGCs中miRNA和mRNA表达谱的影响一、目的采用机械方法获取小鼠原代卵巢颗粒细胞,并在体外探讨MC-LR对mGCs中miRNA和mRNA表达谱的影响,筛选出与mGCs功能相关且异常表达的miRNA 和 mRNA。二、方法1.取三周龄Balb/c小鼠,采用机械分离法分离小鼠mGCs。采用FSHR免疫荧光试剂和流式细胞标记CD45来鉴定mGCs。2.采用免疫荧光和蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测MC-LR能否进入 mGCs。3.采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和流式细胞仪,检测不同浓度MC-LR染毒mGCs后细胞活力和存活率的改变,确认mGCs的最佳染毒浓度,为miRNA和mRNA芯片确定最适的染毒浓度。4.采用杂交miRNA芯片法,筛选MC-LR染毒mGCs后表达变化的miRNA。采用MTA 1.0基因芯片筛选出异常表达的mRNA。5.采用Real-time PCR(RT-PCR)实验技术验证miRNA.和mRNA芯片的准确性。6.利用生物信息学方法分析差异表达的miRNA和mRNA参与的信号通路和生物过程。7.采用Cytoscape软件构建miRNA与mRNA互作网络图。通过miRanda及TargetScan网站预测出异常表达的miRNA的可能靶基因并与mRNA芯片结果取交集,即可构建miRNA-mRNA网络关系图。三、结果1.通过机械分离法成功分离得到mGCs,经FSHR和流式细胞标记CD45鉴定所得细胞为mGCs,且细胞纯度>94%。2.免疫荧光和Western Blot法证实MC-LR能够进入mGCs。3.CCK-8细胞毒性实验发现:5 μM和20 MC-LR染毒mGCs 48 h后,细胞活力显著降低。流式细胞实验发现5 和25 μM MC-LR显著增加了 mGCs的凋亡率。光镜下观察发现大部分细胞在5 MC-LR下仍然保持正常的细胞形态,而在20 μMMC-LR下有部分细胞死亡。综合以上实验结果,我们选定5 μMM MC-LR作为后期芯片实验的染毒浓度。4.5 μM MC-LR染毒mGCs 48 h后,通过miRNA芯片发现共有125种miRNA表达发生改变,其中75种miRNA表达上调,50种表达下调。通过MTA 1.0基因芯片发现共有283种基因表达发生改变,其中121种上调,162种下调。5.利用RT-PCR实验证明miRNA和mRNA芯片的结果是可靠的。6.通过GO分析发现,表达变化的miRNA和mRNA主要参与细胞的粘附,凋亡和免疫等生物化学过程。KEGG分析发现异常表达的miRNA和mRNA主要参与代谢、激素分泌、细胞凋亡、癌症及细胞周期等信号通路。7.通过构建 miRNA-mRNA 网络关系图发现,miR-29b-3p,miR-29a-3p,miR-29c-3p,miR-1906,miR-182-5p,Gab2,Fos,Igf1,Man1a 是关键的 miRNA 和mRNA,这表明这些miRNA和mRNA在MC-LR引起的mGCs毒性作用中可能扮演着重要的角色。四、结论1.MC-LR染毒mGCs后能够引起125种miRNA和283种基因的表达发生变化,表明了 MC-LR诱导的雌性哺乳动物生殖毒性与miRNA之间存在着直接或间接的联系。2.MC-LR染毒mGCs后异常表达的miRNA和mRNA将会影响mGCs中相关基因的表达,从而影响mGCs的正常生物功能。mGCs具有合成激素的重要生物功能,而激素的紊乱又会导致雌性生殖系统异常,因此miRNA在雌性生殖系统正常发育中起着至关重要的作用。第二部分miR-3473g在MC-LR导致小鼠卵巢颗粒细胞孕酮合成紊乱中的作用及其机制研究一、目的通过体外实验,探讨miR-3473g在MC-LR引起mGCs孕酮合成紊乱中的作用机制。二、方法1.MC-LR对mGCs中孕酮分泌、miR-3473g、StAR和CYP11a1表达的影响(1)将细胞均分为6组,分别以0μM、0.04μM、0.2μM、1 μM、5 μM、20 μM的MC-LR和100 nM睾酮以及50ng/ml的卵泡刺激素(FSHH)共同处理48 h,采用ELISA法检测MC-LR染毒mGCs后,细胞培养上清中孕酮的浓度变化。(2)利用Taqman探针,采用RT-PCR法验证芯片结果中miR-3473g的表达。不同浓度MC-LR染毒mGCs,采用RT-PCR法检测StAR、CYP11a1在mRNA水平的表达;采用Western blot技术检测StAR、CYP11a1在蛋白水平的表达。2.miR-3473g在MC-LR引起mGCs分泌孕酮水平改变中的作用机制(1)构建含有StAR和miR-3473g互补配对碱基序列的双荧光素酶报告基因重组质粒,采用脂质体转染外源性miR-3473g mimics或miRNA:negative control和重组质粒(野生型重组质粒和突变型重组质粒)或空载质粒进入293T细胞,验证miR-3473g与StAR之间的靶向作用关系。(2)mGCs 转染 miR-3473g mimics、miR-3473g inhibitor 或 miRNA negative control,并同时染毒5_MC-LR 48 h 后,采用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光法分别在转录水平检测miR-3473g、StAR和蛋白水平检测StAR、CYP11a1的表达,确认miR-3473g对StAR的调控作用。(3)通过脂质体转染 miR-3473g mimics、miR-3473g inhibitor 或 miRNA negative control进入mGCs并同时用5 MC-LR,100 nM睾酮和50 ng/ml FSH共同处理48 h后,采用ELISA法检测细胞培养上清中孕酮水平的变化,确认miR-3473g在MC-LR诱导mGCs合成孕酮过程中的作用。三、结果1.荧光素酶报告基因实验证实StAR是miR-3473g的靶基因。2.RT-PCR检测miR-3473g的表达变化趋势与芯片保持一致。mGCs经MC-LR处理后,StAR和CYP11a1在mRNA水平和蛋白水平的表达均上升。3.通过ELISA实验发现,随着MC-LR染毒浓度的增加,mGCs分泌的孕酮呈上升趋势。4.调控mGCs中miR-3473g的表达,可以调控StAR的表达,并且可以调控孕酮合成相关基因CYP11a1的表达。5.当通过脂质体转染 miR-3473g mimics、miR-3473g inhibitor 或 miRNA negative control 进入 mGCs 并同时用 5μMC-LR,100 nM 睾酮 50 ng/ml FSH共同处理48 h后,相比于mi-NC+M和in-3473g+M组,mi-3473g+M组的mGCs培养上清中孕酮水平显著下降;in-3473g+M组的mGCs培养上清中孕酮的水平与in-NC+M相比显著上升。6.通过脂质体转染 miR-3473g mimics、miR-3473g inhibitor 或 miRNA negative control 进入 mGCs 并同时用 5 μMMC-LR,100 nM 睾酮和 50 ng/ml FSH共同处理48 h。我们发现MC-LR组的孕酮/雌二醇比值明显高于NC组;相比于mi-NC+M和in-3473g+M组,mi-3473g+M组的比值明显减小,说明上调miR-3473g的表达能够降低孕酮和雌二醇的比值,抑制mGCs过早黄体化的发生。四、结论1.体外实验证实,MC-LR对mGCs具有毒性作用,可通过下调mGCs中miR-3473g的表达,导致StAR表达上调,引起下游孕酮相关基因的表达发生变化,并最终导致mGCs分泌的孕酮水平发生改变。2.在mGCs中,上调miR-3473g的表达可以抑制MC-LR诱导的孕酮水平的升高。3.调控miR-3473g的表达能够影响孕酮和雌二醇的比值;上调miR-3473g的表达能够降低孕酮和雌二醇的比值,抑制mGCs过早黄体化的发生。本研究的特色与创新1.首次采用芯片技术研究MC-LR对mGCs中miRNA和mRNA表达谱的影响。并采用生物信息学技术分析了 MC-LR染毒mGCs后异常表达的miRNA和mRNA所参与的生物过程和信号通路,并通过构建miRNA-mRNA网络关系图寻找关键的miRNA和mRNA。2.首次发现miR-3473g在MC-LR引起的mGCs孕酮合成紊乱中发挥着重要的作用,并确认了 miR-3473g与StAR之间的靶向关系,探明了 miR-3473g在MC-LR引起mGCs分泌孕酮紊乱过程中的分子机制。