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目的:本研究以甲基化CpG结合蛋白2(Methyl-CpG-Binding protein2,MeCP2)作为DNA甲基化位点特异性识别单元,以纳米金(Gold nanoparticles,AuNPs)修饰电极和双酶标记抗体作为信号放大体系,构建一种简单灵敏的电化学生物感器用于DNA甲基化的定量检测。方法:1.双酶标记抗体的制备。采用戊二醛交联法和过碘酸钠法将葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)共同修饰到抗6×His鼠单克隆抗体上,并用紫外-可见分光光谱法对所制备的双酶标记抗体GOD-HRP/IgG进行表征。2.DNA电化学生物传感器的构建。采用电沉积法在电极表面修饰上AuNPs,以自组装的方式依次将DNA探针、巯基己醇和靶DNA连接到电极上,构建DNA电化学生物传感器。通过扫描电子显微镜和原子力显微镜对电沉积纳米金和探针固定的形貌进行表征鉴定,并用循环伏安法和电化学阻抗法对每一步组装效果进行电化学表征。3.可行性分析。设计相同碱基序列的非甲基化和含1个甲基化位点的靶DNA,制备DNA电化学生物传感器,与MeCP2作用后,再和GOD-HRP/IgG反应,在含葡萄糖和对苯二酚的检测液中进行差分脉冲伏安扫描,对比甲基化与非甲基化靶DNA检测结果;同时考察实验所设计的双酶信号放大策略的放大效果,进行方法可行性的分析。4.优化重要实验参数。对杂交时间、MeCP2浓度、最适抗体量以及底物葡萄糖浓度等实验条件进行优化。5.DNA甲基化位点定量分析。设计相同碱基序列不同数量甲基化位点的靶DNA,采用所制备的电化学生物传感器分析对应的电流信号,建立不同数量甲基化位点与电信号之间的相关关系。6.考察电化学生物传感器的分析性能,灵敏度、重复性和稳定性。结果:1.紫外可见分光光谱扫描曲线中可见GOD-HRP/IgG的吸收峰分别向GOD和HRP最大吸收峰处移动,表明双酶修饰抗体成功。2.扫描电子显微镜显示AuNPs呈球状、分布均匀;原子力显微镜鉴定结果表明,AuNPs大小与扫描电子显微镜显示结果一致,DNA分布有序;循环伏安法和电化学阻抗法共同表明各成分均成功组装在电极表面。3.可行性验证结果表明,该方法可有效区分甲基化与非甲基化序列,同时实验设计的双酶标记体系产生的电化学响应信号明显强于单酶标记体系,具有较好的信号增强效果。4.基于实验结果,综合考虑采用的最佳杂交时间为90 min、MeCP2浓度为200 mg/L、抗体浓度为10mg/L、葡萄糖浓度为0.5 mmol/L。5.采用所制备的电化学生物传感器分析不同甲基化数量靶序列DNA的电流信号,结果显示,在1~5个甲基化位点范围内,峰电流的强度与靶DNA甲基化位点的数量呈线性关系,线性方程为I(μA)=7.550 N+1.328,相关系数r为0.984。6.该方法可检到低至0.1 fmol/L的甲基化靶序列DNA,灵敏度高,线性范围宽,重复性、稳定性均良好。结论:成功构建用于DNA甲基化检测的电化学生物传感,能有效区分多个甲基化位点的靶序列DNA,有望成为临床DNA甲基化定量分析的有效手段。