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目的: 金黄色葡萄球菌,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是引起临床感染的常见病原菌,为导致医院感染和社区感染的主要病原菌,也是生物膜严重感染的常见病原菌,是医院感染控制的重点监测对象.因此对生物膜的形成机制和其毒力因子的研究成为抗感染领域研究热点.本研究探讨亚抑菌浓度莫匹罗星药物对金黄色葡萄球菌体外生物膜形成能力以及毒力因子α毒素(Alpha hemolysin,Hla)表达的影响以及其调控作用. 方法: ① 收集温州医科大学附属第一医院分离鉴定的10株金黄色葡萄球菌,质控菌株选用金黄色葡萄球菌ATCC25923;PCR方法检测金黄色葡萄球菌的mecA基因、icaA基因和耐药基因mupA、qacA/B基因;采用多位点序列分型方法(MLST)对金黄色葡萄球菌分型鉴定;根据CLSI标准采用微量肉汤稀释法分别测定实验菌株的莫匹罗星的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);并且检测不同浓度莫匹罗星对其中两株金黄色葡萄球菌生长的影响. ② 运用96孔板初步检测金黄色葡萄球菌生物膜形成的能力;取生物膜形成能力强阳性的菌株,分别在培养的同时加入1/32MIC(32μg/ml)、1/16MIC(64μg/ml)、1/8MIC(128μg/ml)浓度的莫匹罗星,培养之后,将玻片固定脱水再用扫描电镜观察.菌株分别用FITC-ConA和PI标记,利用激光共聚焦显微镜观察不同浓度莫匹罗星对生物膜形成的影响.荧光定量RT-PCR检测亚抑菌浓度莫匹罗星对金黄色葡萄球菌icaA表达的影响. ③ 金黄色葡萄球菌经过培养16h后,分别依次收集细菌与上清.荧光定量RT-PCR检测亚抑菌浓度莫匹罗星对α毒素mRNA水平的表达的影响;红细胞溶血试验检测亚抑菌浓度莫匹罗星对溶血活性的影响;ELISA检测亚抑菌浓度莫匹罗星对α毒素蛋白产物的影响;由于α毒素是细胞外分泌蛋白,培养16小时后收集上清离心沉淀法提取后进行SDS PAGE,转膜后免疫印迹,以anti-hla作为一抗,山羊抗兔IgG作为二抗检测亚抑菌浓度莫匹罗星对细菌培养上清中α毒素蛋白表达的影响. ④由Beacon Designer设计荧光定量引物,RT-PCR检测金黄色葡萄球菌转录调控因子agrA、sarA和saeR在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表达变化. 结果: ① 10株临床分离株为mecA阳性,判断为MRSA;耐药基因mupA、qacA/B阳性.金黄色葡萄球菌对莫匹罗星的MIC值为1024μg/ml,均≥512μg/ml,为高水平莫匹罗星耐药.1/32MIC(32μg/ml)、1/16MIC(64μg/ml)、1/8MIC(128μg/ml)亚抑菌浓度莫匹罗星对金黄色葡萄球菌生长后期无明显抑制作用;96孔板结晶紫染色结果显示为SA001生物膜强阳性;其中表皮葡萄球菌ATCC35984为生物膜阳性对照菌株.与未加药的SA001相比,在1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC亚抑菌浓度莫匹罗星作用下生物膜形成能力减弱,并非为浓度依赖性,特别是1/8MIC浓度显著抑制生物膜的形成.扫描电镜观察未加莫匹罗星的细菌生物膜的形成明显,细菌排列密集,1/32MIC组的生物膜形成很薄,而1/16MIC-1/8MIC组几乎未形成生物膜,细菌都是单个分离状态.激光共聚焦扫描显微镜结果与扫描电镜结果类似,在加入1/32MIC-1/8MIC的莫匹罗星共培养后,绿色荧光散落分布,生物膜形成稀疏;而未加入莫匹罗星的金黄色葡萄球菌形成紧密的生物膜.icaA的荧光定量RT-PCR结果为1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC亚抑菌浓度莫匹罗星作用下icaA的相对表达逐渐减少. ② SA001-SA004的α毒素活力在1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC亚抑菌浓度莫匹罗星作用下明显减弱,与阴性对照结果数值相近,远低于未加莫匹罗星组的数值;SA001-SA010的hla转录水平在1/32MIC亚抑菌浓度莫匹罗星的作用下表达显著减少;ELISA结果为1/32MIC亚抑菌莫匹罗星作用下10株菌的α毒素抗体效价明显减小.随着莫匹罗星药物浓度的增加,western blot结果为SA001和SA002的培养上清中的α毒素逐渐减少,在1/8MIC浓度α毒素蛋白的表达量最低. ③ 亚抑菌浓度莫匹罗星对金黄色葡萄球菌作用后,agrA、saeR和sarA的相对表达量显著减少,结果显示可能通过agrA、saeR和sarA下调α毒素的表达. 结论: ① 亚抑菌浓度莫匹罗星能够显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,可能通过抑制icaA的表达影响生物膜的形成. ② 亚抑菌浓度莫匹罗星能够显著抑制金黄色葡萄球菌毒力因子α毒素的表达,其机制可能主要通过下调agrA和saeR影响α毒素的表达.