人血清白蛋白(humanserumalbumin，HAS)是人血浆中最丰富的蛋白质，在人体内起着维持血液渗透压、运输、营养等作用。因而在国内外都有很大的市场需求。禽类输卵管生物反应器是基因制药的新方法，其生产药用蛋白具有安全、高效、成本低廉等优点，因此，通过制备禽类输卵管生物反应器生产人血清白蛋白将具有美好的前景。 禽类生物反应器的研究，主要在于能构建在禽类体内能有效调控外源基因表达的特异表达载体。其中上游载体的构建首要条件，实现外源基因在鹌鹑输卵管组织中的特异性表达必须有组织特性型的启动子的参与。本试验以鹌鹑卵清蛋白5’调控区为调控序列，来启动人血清白蛋白HAS的表达，构建了含有新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白报告基因的人血清白蛋白输卵管特异性表达载体，为下一步通过体细胞核移植法制备输卵管生物反应器生产人血清白蛋白打下坚实的基础。本实验主要从以下几个方面进行了研究，其结果如下： 1.人血清白蛋白基因的克隆 RT-PCR技术成功地扩增，克隆了含人血清白蛋白序列长约1.8kb的片段，经电泳初步鉴定为目的基因后，产物纯化后连至pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5a。.筛选阳性克隆菌，酶切鉴定并进行序列分析酶切鉴定并进行测序，结果与GeneBank中登录的人的血清白蛋白cDNA序列的同源性为97％，有个别碱基发生突变，突变并没有引起最大读码框的改变，即成功的克隆了HSA的cDNA序列。 2人血清白蛋白鹌鹑输卵管特异表达载体的构建 (1)以鹌鹑卵清蛋白5’调控区POV来启动HAS的表达。重新设计HSAcDNA引物，分别在上下游引物5’端添加含有限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ酶切位点，重新扩增了HAScDNA序列。用限制性内切酶klanⅠ和HindⅢ双酶切质粒pOV和pHSA，然后用T4连接酶定向连接成重组质粒pOV-pHSA，经酶切鉴定，两者成功融合。 (2)采用双酶切定向克隆的方法，利用真核表达载体pIRES2-EGFP构建了含有抗性基因、报告基因的人血清白蛋白非融合型输卵管表达载体pEGFP-VH。用PCR方法和酶切方法检测，表明其中的整个人血清白蛋白输卵管表达构件插入位点准确无误。 3人血清白蛋白基因在鹌鹑输卵管上皮细胞和鹌鹑成纤维细胞表达 (1)培养了鹌鹑自身的两种细胞：鹌鹑输卵管上皮细胞和鹌鹑胚胎成纤维细胞作为检测平台，将重组后的人血清白蛋白表达载体用脂质体包埋法转染以上两种细胞，通过荧光显微镜观察到报告基因绿色荧光蛋白的表达，结果表明构建的表达载体在成纤维细胞上未见表达；而鹌鹑原代输卵管上皮细胞上有表达. (2)取转染细胞的基因组DNA，设计特异性的检测引物，用 PCR法筛选法检测了报告基因表达的阳性细胞克隆，SDS-PAGE银染色法确定鹌鹑输卵管上皮细胞分泌蛋白的分子量，结果显示在转染的鹌鹑输卵管上皮细胞培养上清中含有分子量约为68kDa的HSA。表明构建的表达载体的是有效的，而且表达构件已经初步整合到阳性鹌鹑输卵管上皮细胞的染色体中。