LCC基生物材料的制备及其与人体肝细胞生物相容性的研究

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作为人体的重要器官——肝脏,却在人体内极易发生病变,有相当一部分人受肝癌、急性肝衰竭等肝脏疾病的困扰。日前,医疗上主要采用肝移植的治疗手段,于是寻找合适的肝脏支架材料是细胞组织工作者在体外进行人工肝脏细胞培养的基础性研究工作。木素-碳水化合物复合体(Lignin-carbohydrate complexes,LCC)具有良好的物理强度、两亲性、生物相容性、可降解性等特性,是一种很好的天然可降解医用高分子材料。本论文对LCC在肝脏组织工程中生物相容性进行了探索。本文选取裸子植物的银杏、被子植物的杨木和麦草为原料分别提取了LCC,通过与丙三醇缩水甘油醚交联的方法制备凝胶材料用于作生物多孔载体,对该生物载体的主要成分含量以及表面形态进行分析。结果表明:对人体肝细胞有较高生物相容性的半乳糖在银杏、杨木和小麦秸秆三种原料的LCC基凝胶材料中分别为2.30%、3.32%以及0.27%,而甘露糖含量分别为21.94%、3.12%和10.13%。用上述三种LCC为原料可以制备水凝胶型的生物载体,平均孔径约为80-120μm。用该多孔生物载体进行人肝细胞培养,发现人肝细胞能够成功地在LCC基凝胶材料上生长,在前2天细胞密度较小,后2天细胞密度增大,后细胞从第5d开始堆积老化和脱落。银杏、杨木和小麦秸秆LCC基凝胶载体同与肝细胞作用,综合比较细胞增长及代谢趋势为:杨木凝胶材料最优,银杏和小麦分别次之,对照组最次,且细胞增殖较快,培养液的ALB值、合成BUN值和GLUCOSE消耗值的测定结果表明肝细胞具有较高的代谢活性。研究结果表明LCC基多孔凝胶材料具有良好的生物相容性。用TEMPO氧化硫酸盐针叶木漂白浆,将木素前驱物松柏醇葡萄糖苷与氧化后的纸浆在漆酶的作用下反应,使生成的脱氢聚合物(DHP)与多糖之间以缩醛键结合生成LCC。合成LCC材料中所含有对人体肝细胞有较高生物相容性的半乳糖和甘露糖组分为3.53%和7.69%。将TEMPO氧化纸浆材料、含合成LCC的纸浆材料与人体肝细胞作用,肝细胞密度在第4d达到最大,综合比较增殖及代谢速率为合成LCC实验组优于TEMPO氧化纸浆实验组,优于对照组。最重要的原因是材料中半乳糖含量较高,促进细胞生长。对培养的代谢液进行检测的结果也表明加入合成的LCC材料有利于提高肝细胞的代谢活性,由此也证明了合成LCC具有良好的生物相容性,为适合组织工程的LCC材料的制备开发了新方法。最后对银杏LCC分离处理,得到可溶性银杏LCC,并制成不同浓度与人体肝细胞L-02培养研究。利用FT-IR和HPLC对LCC的化学结构和主要成分含量进行分析。然后将不同浓度(0.1%、0.5%、1.0%)的可溶性银杏LCC与肝细胞培养。培养过程中人工计数且结合倒置显微镜观察了解细胞的生长情况。并收集代谢液对其进行成分检测,从而了解细胞的代谢活性。研究结果表明,与空白样相比,实验组(浓度0.1%-0.5%)培养的细胞在前三天生长较好,而浓度1.0%的实验组由于半乳糖在体系中浓度过高,反而遏制了细胞的生长。通过测定培养液的白蛋白量(ALB)、合成尿素量(BUN)和消耗葡萄糖量(GLUCOSE),发现细胞的代谢活性在第3天有一个最高值。结果表明:可溶性LCC浓度为0.1%、0.5%时,培养到第3天时肝细胞的代谢活性为最佳。
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