论文部分内容阅读
白腐菌能分泌多种碳水化合物活性酶（CAZyme）参与自然界木质纤维素的降解,也是β-葡萄糖苷酶、漆酶等木质纤维素降解酶的重要来源。实验室前期研究中筛选到一株耐热毛栓菌Trametes trogii S0301,该菌株具有生长速度快,木质纤维素利用能力强,漆酶产量高等特点。然而,耐热毛栓菌中CAZy对木质纤维素的响应尚未见研究,同时该菌株中木质纤维素降解酶基因资源的利用也很有限。本研究以耐热毛栓菌T.trogii S0301为出发菌株,借助转录组测序分析了耐热毛栓菌T.trogii S0301在葡萄糖和天然木质纤维素共培养条件下基因表达变化及碳源转换过程中CAZy酶编码基因对木质纤维素的响应;对β-葡萄糖苷酶Ttbgl3和漆酶Lac13的表达及Ttbgl3对糖苷类化合物的转化进行了研究,主要研究结果如下:1.耐热毛栓菌T.trogii S0301中CAZy酶对木质纤维素响应的转录组分析实验室前期研究从耐热毛栓菌T.trogii S0301三代基因组序列中预测到602个CAZy酶编码基因,但它们对木质素纤维素的响应情况并不清楚。为研究耐热毛栓菌T.trogii S0301中CAZy酶对木质纤维素的响应及其木质纤维素降解酶的分泌模式,在葡萄糖和天然木质素下共培养T.trogii S0301。在第5d的培养基中葡萄糖的基本耗尽,随后菌丝开始利用天然木质纤维素生长,同时伴随着β-葡萄糖苷酶、EG、纤维素酶、木聚糖酶、Mn P、Li P等木质纤维素利用酶活性迅速增加。转录组测序分析发现,第5 d到第8 d,编码AA、CBM、GH等基因家族的基因数量分别从31增加到44、21增加到27以及50增加到121。其中上调最显著的是编码GH家族的基因。第2d到第5d过程中Mn P等木质素降解酶基因高度表达,同时编码纤维素酶、半纤维素酶基因的也被快速诱导。到第8天时,Mn P表达量迅速下降,其余醇氧化酶、壳寡糖氧化酶、半乳糖氧化酶、血红素过氧化物酶、GMC氧化还原酶、乙二醛氧化酶GLOX等氧化酶或过氧化物酶持续积累,协同AA9家族裂解多糖单加氧酶（LPMOs）、GH家族β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶等纤维素、半纤维素降解酶持续降解木质纤维素。胞外木质纤维素降解酶活性的同步增加与转录组分析的结果一致,揭示了耐热毛栓菌T.trogii S0301同时降解木质纤维素的模式。此外,在这个过程中还涉及到多个转录因子（ZBTB、zf-C2H2、Homeobox等）调节多种酶的协同作用。2.Ttbgl3的原核表达与糖苷类化合物的转化以β-葡萄糖苷酶为代表的木质纤维素降解酶在食品生物加工和医药工业等方面表现出良好的应用前景。本研究基于转录组分析结果选择GH3家族中被木质纤维素显著性上调的β-葡萄糖苷酶基因Ttbgl3,在0.1 m M IPTG,20°C,培养12h的诱导条件下Ttbgl3重组酶表达量最高;酶的性质分析表明,以p NPG为底物时,Ttbgl3最适温度为50°C,最适p H为6.0,在50°C下和p H 5-10内稳定性较好;Fe3+能够提高Ttbgl3的活性至119.6%。除10%SDS完全抑制Ttbgl3的活性外,Ttbgl3在其他有机溶剂中均能保持50%以上的酶活性。此外,低浓度20 m M葡萄糖对重组酶Ttbgl3有着明显的抑制作用。Ttbgl3的Km值为1.04 m M,Vmax为263.16μM/mg/min。重组酶Ttbgl3糖苷类化合物转化分析表明,Ttbgl3能够水解天麻素、七叶苷和大豆苷等β-葡萄糖苷键的化合物,也能水解黄芩苷类含有β-葡萄糖醛酸苷键的化合物。对酶浓度和转化时间进行优化,在天麻素500μg/m L,Ttbgl3 60 U/m L,37°C孵育12 h,对羟基苯甲醇转化率为0.17 m M/h;七叶苷500μg/m L,Ttbgl35 U/m L,37°C孵育2 h,七叶内酯转化率为0.96 m M/h;大豆苷500μg/m L,Ttbgl35 U/m L,37°C孵育0.5 h,大豆素转化率为1.47 m M/h。通过同源建模和分子对接,推测His85和Lys467两个残基可能为含有β-葡萄糖苷键的底物的酶结合位点,Glu377和Thr424可能为含有β-葡萄糖醛酸苷键的底物的酶结合位点。3.耐热毛栓菌T.trogii S0301中漆酶同工酶Lac13在毕赤酵母中的表达实验室前期研究中已经从耐热毛栓菌T.trogii S0301中克隆到多个漆酶同工酶基因,本研究中利用毕赤酵母异源表达体系,构建了Lac13自身的信号肽去除和保留的质粒（p PICZα-Lac13a和p PICZα-Lac13b）,Lac13自身的信号肽的去除后能检测漆酶活性。对Cu2+浓度、p H和温度等诱导条件进行了优化,当1%甲醇、0.5 m M Cu2+、p H 6.0,25°C诱导7天时漆酶显色颜色最深,活性最高。通过阴离子柱分离纯化得到较纯的Lac13漆酶蛋白。综上所述,本研究对在葡萄糖和天然木质素共培养条件下的T.trogii S0301进行转录组测序和胞外酶活的测定,揭示了耐热毛栓菌T.trogii S0301响应木质纤维素过程中基因的表达规律及木质纤维素降解酶的分泌模式。通过该菌株中Ttbgl3的原核表达、性质分析和苷类化合物的转化研究,发现了Ttbgl3能够高效转化多种苷类化合物;建立了毕赤酵母表达体系,成功表达了活性形式的漆酶同工酶Lac13。这些研究结果为进一步探索耐热毛栓菌高效利用木质纤维素机制及木质纤维素酶基因资源开发奠定基础。