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第一部分膀胱癌术后复发危险因素分析目的：分析我院膀胱癌行保留膀胱手术后复发的发生率及其危险因素。材料与方法：452例初发膀胱癌患者,于2003年1月-2010年6月在我院行保留膀胱的手术治疗(膀胱部分切除或经尿道肿瘤切除),术后病理证实为膀胱尿路上皮癌。所有患者随访2年,收集患者的一般资料(年龄、性别、吸烟史等)、肿瘤学特征(肿瘤数目、分期、分级)、术后治疗方案和术后复发的频度。按2年内复发的频度分为无复发组、低复发组(2年内复发1次)和高复发组(2年内复发2次及以上),比较各组临床病理特征的差异。对2年内有复发的低级别肿瘤患者按照复发后肿瘤分级是否改变分组,又分为无进展组(2年内肿瘤分级未增高)和进展组(2年内肿瘤分级增高),比较2组临床病理特征的差异。结果：452例患者2年内肿瘤复发204例(45.1%),其中127例为低复发组,77例为高复发组。而其余248例为无复发组。三组患者吸烟、肿瘤分级、肿瘤分期、肿瘤数目、接受规范膀胱灌注化疗和接受干扰素治疗的比例有非常显著性差异(P<0.001)；年龄、性别、术后全身化疗、放疗和BCG治疗比例无显著性差异(P>0.05)。复发的低级别肿瘤共110例,其中无进展组79例,进展组31例。两组患者吸烟、肿瘤分期有非常显著性差异(P<0.001)；年龄、性别、肿瘤数目和术后是否规范的膀胱灌注化疗的比例无显著性差异(P>0.05)。结论：术前吸烟史、肿瘤分级、分期、肿瘤多发和未接受规范膀胱灌注化疗是膀胱癌患者术后复发的危险因素。而在术后随访中发现,初发肿瘤分期较高和术后继续吸烟的患者在复发时肿瘤分级增高的危险性增加。第二部分人膀胱癌细胞中RASSFIA基因甲基化状态分析目的：了解T24膀胱癌细胞株中RASSFIA基因甲基化状态及其与细胞增殖、侵袭能力的关系。材料与方法：用浓度分别为0.1μmol/1、2.5μmol/1和12.5μmol/1的DNA甲基化酶抑制剂5—杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)处理T24膀胱癌细胞株,分别为低剂量组、中剂量组和高剂量组。然后各组用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞检测细胞凋亡率和细胞周期改变,TransweLL法检测细胞侵袭能力。RT—PCR法检测RASSF1A基因转录水平,Western-blot检测其蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP法)检测药物处理后RASSF1A基因甲基化状态。结果：5-aza-dc低剂量、中剂量和高剂量组对T24膀胱癌细胞株24h细胞生长抑制率分别为7.621、8.297和8.478。流式细胞检测显示空白组、对照组和低剂量、中剂量、高剂量组细胞凋亡率分别为2.5%、2.9%、4.2%、5.7%和13.8%。各组细胞周期无明显变化。Transwell法检测药物处理后细胞侵袭受明显抑制,侵袭抑制率呈剂量相关性。MSP检测发现空白组和对照组RASSF1A呈完全甲基化状态,低剂量组呈部分甲基化状态,中剂量和高剂量组呈无甲基化状态。RT-PCR和Western-blot检测显示药物处理后RASSF1A基因转录水平升高、蛋白质表达增加。结论：在T24膀胱癌细胞株中RASSF1A基因呈完全甲基化状态。甲基化酶抑制剂5-aza-dc可抑制该基因甲基化,使RASSF1A转录水平升高、蛋白质表达增加,从而使细胞增殖能力减弱、凋亡增加、细胞侵袭能力减弱。第三部分转染miR—143和miR-29a对人膀胱癌细胞生长和侵袭能力的影响及其与ASSF1A基因甲基化的关系目的：研究miR-143和miR—29a对T24膀胱癌细胞株生长、侵袭能力的影响,及其与RASSF1A基因甲基化的关系。材料与方法：化学合成miR—143和miR-29a的模拟物(mimics),并转染进入T24膀胱癌细胞株。通过RT-PCR验证miRNA mimics的转染效果。根据转染mimics的不同,分为WT组(不作任何处理的T24细胞)、NC组(转入不含miRNA的mimics的阴性对照)、M1组(转入含miR—143的mimics)、M2组(转入含miR-29a的mimics)。流式细胞检测各组细胞凋亡率和细胞周期改变,Transwell法检测细胞侵袭能力,RT-PCR和Western-blot检测RASSF1A基因转录水平和蛋白质表达,MSP检测RASSF1A基因甲基化状态。结果：RT-PCR证实两组mimics转染成功。WT组、NC组、M1组和M2组的细胞凋亡率分别为2.5%、3.4%、12.4%和13.3%。M1组和M2组S期细胞有所增加。NC组、M1组和M2组细胞侵袭抑制率分别为0.020、0.165和0.132,M1和M2转染组高于NC组,有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR和Western-blot检测显示,转染miR-29a的M2组RASSF1A转录水平和蛋白质含量较NC组增加,M1组无明显变化。MSP检测显示,WT组、NC组和M1组RASSF1A基因均呈完全甲基化,M2组呈部分甲基化状态。结论：转染miR—143和miR一29a可使T24膀胱癌细胞株细胞凋亡增加、侵袭能力减弱。转染miR一29a可以部分抑制miR-SSF1A基因甲基化,从而使该基因转录水平和蛋白质表达增加。第四部分不同复发频率的人膀胱癌组织中RASSF1A基因甲基化状态和miR-143、miR-29a表达分析目的：探讨人膀胱癌组织RASSF1A基因甲基化状态以及miR-143、miR-29a表达与膀胱癌复发的关系。材料与方法：选择2008年-2009年我院膀胱癌患者行膀胱部分切除30例,按不同复发频率分为无复发组、低复发组(2年内复发1次)、高复发组(2年内复发2次及以上),每组10例。MSP法检测各组细胞RASSF1A甲基化状态,RT-PCR检测niR-3p-143、miR-3p-29a、miR-5p-29a的表达。结果：各组患者性别、年龄、肿瘤数量、分期无显著性差异,而高复发组的高级别肿瘤比例较高。无复发组、低复发组、高复发组中RASSF1A基因完全或部分甲基化的比例分别为40%、80%和100%,有显著性差异(P<0.05)。三组患者miR-3p-143含量分别为122.68、3.49和0.77,miR-3p-29a含量分别为246.99、65.60和62.25,miR-5p-29a含量分别为11.30、3.65、2.20。统计学检验显示,miR-3p-143表达无复发组明显高于另两组,低复发组亦高于高复发组,有显著性差异(P<0.05)。miR-3p-29a和miR-5p-29a表达无复发组高于另两组,有显著性差异(P<0.05),但低复发组和高复发组间无明显差异(P>0.05)。RASSF1A基因甲基化但肿瘤2年内未复发组与无甲基化但肿瘤2年内复发组之间比较,miR-3p-143含量分别为99.98±44.90和5.57±1.73,有显著性差异(P<0.05);miR-3p-29a含量为133.27±19.64和210.78±187.52,miR-5p-29a含量为7.47±1.07和5.49±1.85,无显著性差异(P>0.05)。结论：人膀胱癌组织中RASSF1A基因呈甲基化。其甲基化状态和miR—143、miR-29a表达在无复发组均高于复发组,提示RASSF1A基因甲基化及miR-143、miR-29a表达与膀胱癌复发有相关性。联合检测RASSF1A基因甲基化状态和miR-143含量可能可以提高预测膀胱癌复发的准确性。