鬼箭羽抗呼吸道合胞病毒有效部位的分离纯化及其抗病毒机制研究

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目的:
  利用体外抗病毒示踪技术,通过不同的分离纯化方法筛选鬼箭羽抗呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Viruses,RSV)的有效部位,在细胞生物学水平通过体外、体内实验检测鬼箭羽有效部位的抗RSV效果,并进一步研究其抗RSV作用机制。
  方法:
  1.采用水提醇沉法获得鬼箭羽粗提物,采用NKA-9、HPD-100、D-101、DM-301、AB-8五种不同极性的大孔吸附树脂柱,分别以蒸馏水、体积分数为25%、50%、75%的乙醇作为流动相对粗提物进一步分离纯化;通过体外抗病毒实验对不同分离纯化部位的体外抗病毒效果进行探究,筛选出抗RSV效果较好的分离纯化部位。
  2.采用超滤法,将较好有效部位溶液进行超滤,得到不同分子量的样品溶液,分别进行体外抗呼吸道合胞病毒实验,得到抗RSV效果最好的有效部位。
  3.对得到的有效部位进行理化鉴别,确定其有效化学成分种类。
  4.对得到的鬼箭羽有效部位,在不同的时间节点将其加入细胞中,初步研究其体外抗RSV机制。
  5.通过建立RSV肺炎小鼠模型,将鬼箭羽有效部位分为高、中、低三个剂量组进行药效学实验,观察各组小鼠体重变化及活动,肺指数变化情况,各用药组肺指数抑制率,肺组织病理切片,探究鬼箭羽有效部位的体内抗病毒效果。
  6.通过ELISA试剂盒方法,对小鼠血液中的炎症因子TNF-α、TNF-β、IFN-α及IL-4的浓度进行检测,探究鬼箭羽有效部位的体内抗RSV机制。
  7.建立RSV肺炎小鼠模型,RT-PCR检测肺组织中病毒载量、TLR3和TLR4的表达水平,初步探究鬼箭羽活性部位对小鼠肺组织中RSV、TLR3和TLR4mRNA表达的影响。
  结果:
  1.从治疗指数(TI值)来看,HPD-100型大孔吸附树脂的水洗脱部位的抗RSV作用最好(TI=52.000),且效果优于利巴韦林。
  2.通过超滤实验对有效部位进一步分离纯化发现分子量小于3000的超滤提取物抗RSV效果最好,TI=83.500,高于利巴韦林(TI=49.500)。
  3.理化鉴别实验显示,其超滤有效部位化学成分为多酚类。
  4.通过不同时间加药实验,发现鬼箭羽有效部位与病毒同时加入细胞TI值最大,说明其对病毒直接灭活作用最强,同时对病毒发挥预防和治疗作用。
  5.体内实验表明,鬼箭羽有效部位可明显改善小鼠肺组织病变、降低小鼠肺指数,降低小鼠肺组织内病毒滴度。
  6.与模型组相比,鬼箭羽有效部位可升高小鼠血清中IL-4、IFN-α浓度,降低TNF-α和TNF-β的浓度
  7.与模型组相比,鬼箭羽活性部位可降低小鼠肺组织内病毒载量,下调TLR3和TLR4的表达水平。
  结论:
  鬼箭羽经水提醇沉、HPD-100型大孔吸附树脂及超滤分离纯化后,得到的有效部位具有一定的抗RSV作用。其化学成分主要为多酚类。体外实验结果表明,鬼箭羽有效部位对病毒的直接灭活作用最强。此外,体内实验结果显示鬼箭羽有效部位可能是通过降低小鼠血清内炎性因子含量,升高抗炎性因子的含量,并且下调TLR3和TLR4的水平来发挥抗病毒效果的。
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