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1研究目的通过研究中药开窍药—冰片提高抗肿瘤药物-顺铂通过血肿瘤屏障的量效、时效关系及冰片对血肿瘤屏障紧密连接蛋白的调控作用,初步明确冰片对血肿瘤屏障开放的调节作用及机制,以期用现代科学语言进一步揭示开窍药的作用模式,并为找寻到提高抗肿瘤药物组织转运的有效途径提供实验基础。2研究方法2.1血肿瘤屏障在体模型—C6脑胶质瘤模型大鼠的建立SD大鼠脑右侧尾状核10min内注射C6细胞,留针10min,缓慢退出后骨蜡封闭,常规消毒,缝合,常规饲养,分别于肿瘤接种后第7天、14天、21天,随机抽取进行MRI观察,并且与相应时间取出模型大鼠的脑组织进行HE染色病理观察,最后确定C6细胞接种量为每只2.5×106个/25μL,治疗时间窗为接种后第14天。2.2冰片对顺铂在C6脑胶质瘤模型大鼠体内药动学及脑组织分布的影响模型大鼠随机分为3组：冰片高剂(140mg/kg)+顺铂(10mg/kg)、冰片低剂(35mg/kg)+顺铂(10mg/kg)、溶媒(0.5%CMC-Na)+』顷铂(10mg/kg),每组28只模型大鼠分为7个时间点,每个时间点4只大鼠。各组模型大鼠分别灌胃相应剂量的冰片,并且于冰片给药1h后,尾静脉注射顺铂。在顺铂注射后相应的时间点取血及脑组织。运用DDTC柱前衍生化HPLC-UV法测定血浆及脑组织匀浆液中顺铂的药物浓度,计算各组的药动学参数。HPLC条件为：色谱柱：C18柱)菲罗门分析柱,250mm×4.6mm,4μ m)；保护柱：菲罗门C18(4mm×4mm)；检测波长：254nm;柱温：28℃。流动相：水-甲醇(20-80)；流速：1mL/min。2.3冰片对血肿瘤屏障紧密连接相关蛋白基因及表达的影响实时荧光定量PCR法测定血肿瘤屏障相关蛋白Claudin-5、Occludin Z0-1及细胞骨架蛋白F-actin mRNA表达的变化；ELISA方法测定Claudin-5、Occludin、Z0-1、 F-actin的蛋白表达变化。3结果成功建立了稳定、可靠的C6脑胶质瘤大鼠模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤类似；成功建立了测定血浆及脑组织匀浆液中顺铂药物浓度的柱前DDTC衍生化HPLC-UV检测方法,目标峰达基线分离,峰形对称,血浆及脑组织匀浆液中内源性物质不干扰测定。血浆中,冰片高剂量组的生物利用度(AUC(0-8h))约为空白对照组的80%,而脑组织中冰片高剂量组的生物利用度(AUC(0-8h))约为空白对照组的2倍,经统计学软件计算结果为AUC高>AUC低>AUC空白,差异具有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR及ELISA测定脑组织血肿瘤屏障上紧密连接相关蛋白Claudin-5、 Occludin、Z0-1、F-actin的表达变化,与正常组相比,冰片作用后,ZO-1、F-actin基因的表达先由高到低再升高,高、低剂量组两基因均分别于30、45min时表达最低,但F-actin基因表达幅度的变化没有ZO-1大；Occludin、Claudin-5两基因的表达相对于对照组以及各个时间点间相互比较变化均无统计学意义(P>0.05)。ELISA测定的Claudin-5、Occludin、Z0-1、F-actin四个蛋白表达的变化与基因表达的变化基本一致。4结论冰片通过调节血肿瘤屏障的通透性,提高了抗肿瘤药物顺铂的脑组织瘤区转运,其中下调紧密连接相关蛋白Z0-1、F-actin的基因及蛋白表达可能是其重要的作用机制之一,至于其是否也同时通过改变Claudin-5、Occludin跨膜蛋白在紧密连接上的位置而发挥此作用,仍有待进一步研究。