过敏反应(hypersensitive response,HR)和坏死(necrosis)是植物-病原物互作最常见的两种现象。一般认为,坏死是由于植物受病原物侵染引起的机械损伤或因某些毒性因子毒害而造成的病理性的细胞死亡,而HR是一种程序化死亡(programmed cell death, PCD),是寄主植物应对病原物侵染的主动的抗病反应,受寄主内在基因的调控,因此HR与坏死在发生机制及细胞对外界刺激的反应上,都有着本质的区别。研究两种死亡的发生机制对正确理解植物-病原物的互作关系具有重要的指导意义。Elicitins是疫霉属(Phytophthora)和腐霉属(Pythium)植物病原卵菌产生的、能在烟草上引起过敏性反应和系统获得抗性(Systemic acquired resistance,SAR)的胞外蛋白质的总称。Elicitins有α型(酸性)和β型(碱性),寄生疫霉(Phytophthora parasitica)产生的Elicitin为α型,称为parasiticein。本实验室已从烟草黑胫病菌(P. parasitica)中克隆了编码parasiticein的基因并体外表达了该蛋白,本文以parasiticein和烟草悬浮细胞为互作体系,探讨了其诱导烟草细胞死亡的形态及生化特征、分析了细胞死亡的发生机制,得到以下几方面的研究结果:1.建立了烟草悬浮细胞培养体系,分析了悬浮细胞的最佳保存方法获得细胞形态规则、分散程度较高、生长速度较快的悬浮细胞系是本研究的基础。首先,通过分析不同培养温度、激素配比、转速、碳源和初始转接量对烟草悬浮细胞生长的影响等,得到烟草悬浮细胞最佳培养条件为, MS培养基+6-BA 0.2 mg/L+NAA 2.0 mg/L,愈伤转接量为5%,蔗糖浓度3%,振荡培养转速为140rpm,培养温度26℃,在此条件下培养10d可使细胞干重达到46.2 g/L。第二,液体振荡培养保存悬浮细胞不仅存在易污染、需经常继代等弊端,而且受实验室条件的限制,因此,正确保存悬浮细胞是本研究能否继续的保障。将液体培养的悬浮细胞返回固体培养基进行愈伤化保存,发现保存后的细胞所形成的愈伤组织洁白、疏松、有更强的生活力。将其再进行液体悬浮培养时,细胞从愈伤组织到形成分散性好的悬浮细胞的过渡期明显缩短,比直接用愈伤组织重新培养可缩短20-30d。此外,该方法细胞存活期长,一般可保存60-75d,并且保存温度范围大,从15℃-30℃都可保存。2. Parasiticein诱导的烟草细胞死亡表现凋亡的典型形态及生化特征细胞凋亡是一种程序化反应,表现许多形态及生化特征,包括原生质膜收缩、染色质浓缩、基因组DNA断裂形成梯状片断等。为了解parasiticein诱导的烟草细胞死亡是否具有凋亡的特征,从以下几方面进行了研究。2.1用浓度约100nmol/L的parasiticein处理烟草细胞后,相差显微镜观察,发现烟草细胞发生细胞膜收缩,与细胞壁间形成空隙和原生质浓缩等;用trypan blue染色后观察,也可发现类似的现象;2.2对诱导处理的悬浮细胞经DAPI染色后,荧光显微镜观察,发现细胞核先后表现染色质凝集、形成颗粒状物等特征;2.3对处理细胞用透射电镜观察,可发现处理细胞不仅表现染色质裂解、液泡膜破裂,还发现核仁降解成小的片断,并形成类凋亡小体的结构等细胞凋亡的典型形态特征;2.4对处理的悬浮细胞提取基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳,在琼胶电泳上出现约360bp-900bp及150-300bp大小的清晰的梯状排列的片断。上述结果表明,parasiticein诱导的烟草细胞死亡具有细胞凋亡的典型形态及生化特征,是一种程序化的死亡。3.Parasiticein诱导烟草细胞凋亡的机制细胞凋亡作为一种主动反应,有多种信号通路的参与,包括活性氧积累、蛋白激酶信号通路的调节等。为检测parasiticein诱导的细胞凋亡是否具有类似的反应,从以下几方面进行了分析:3.1用荧光探针DCFH-DA对parasiticein处理的烟草细胞在荧光显微镜下进行了观察,结果发现,在处理的4-8h,细胞呈现较强的绿色荧光,表明胞内产生了大量的活性氧,10h后,绿色荧光开始减弱,表明此时活性氧含量开始下降。进一步对处理细胞的H2O2进行检测,发现H2O2的积累表现类似的趋势,第一个峰出现在处理后4 h,第二个峰出现在处理后8 h,且第二个峰值大于第一个峰值,说明H2O2可能是活性氧的主要形式。3.2对处理细胞的活性氧代谢相关酶进行了检测,发现SOD、POD和CAT等的活性在诱导处理后均有不同程度的变化,表明它们在活性氧代谢过程中可能发挥不同的作用;3.3为明确氧化反应在烟草细胞死亡中的作用,进一步用抗氧化剂抗坏血酸盐对parasiticein诱导的烟草细胞死亡进行了分析,结果发现parasiticein可使细胞发生凋亡的时间延缓15-20小时,此外,抗坏血酸盐对parasiticein诱导的SOD、POD和CAT等酶的活性也有不同程度影响,这些结果进一步表明,活性氧是parasiticein诱导烟草细胞凋亡的重要因子。3.4用蛋白激酶抑制剂K252-a对parasiticein诱导的烟草细胞死亡分析发现,parasiticein诱导的烟草细胞死亡可被K252-a所部分抑制,表明parasiticein诱导的烟草细胞死亡,受蛋白激酶信号通路的调控。4.总结综合以上结果我们认为,parasiticein诱导的烟草细胞死亡不仅表现细胞凋亡的典型形态和生化特征,而且有不同信号通路的参与,因此,是一种程序化的死亡。