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研究背景重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是一种自身免疫性疾病,特征是神经肌肉接头(Neuromuscular junction,NMJ)的突触传递障碍,引起波动性的肌无力。大约80%的MG由针对烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic Acetylcholine receptor,nAChR)的抗体介导,这些抗体通过增加AChR的降解和转换,减少纤维终板上功能性AChR的数量,阻断乙酰胆碱与AChR的结合,诱导补体介导的肌肉纤维的损伤。最新研究结果显示,低密度脂蛋白受体相关蛋白4(Low density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4)与肌肉特异性受体酪氨酸激酶(Muscle specific kinase,MuSK)、烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic Acetylcholine receptor,nAChR)一起组成了NMJ终板膜特有的功能单元LRP4-MuSK-nAChR,该功能单元在神经肌肉兴奋化学传递的过程中发挥了重要作用。课题组前期研究发现MG患者肌肉中分拣微管连接蛋白17(Sorting nexin 17,SNX17)含量较非MG患者明显增高,并已证明SNX17与AChR共定位于NMJ处。SNX17属于细胞分拣微管连接蛋白家族的一员,主要通过FERM-like基元与低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor,LDLR)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)、P选择素和载脂蛋白2(theε2 isoform of ApoE,ApoER2)等多种膜蛋白胞内域NPxY基元结合,促进这些膜蛋白高效率循环再利用到细胞膜。生物信息学研究显示,LRP4与LRP1同属于低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)家族,具有类似的NPx Y基元,因此,SNX17与LRP4存在相互作用可能,可使LRP4逃避溶酶体降解,促进LRP4在胞内的循环利用。为验证上述推测,本研究通过分别表达LRP4胞内区和SNX17,采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、蛋白质印迹实验(Western blot)明确两者之间相互作用关系,分析SNX17在MG患者NMJ处的作用。方法1.从MG患者肌肉中提取总RNA,用反转录试剂盒将其反转录成cDNA,以LRP4胞内区基因为模板设计引物,扩增出LRP4胞内区基因。2.利用分子克隆技术等方法,构建pET30a-LRP4胞内区原核表达质粒,并进行双酶切鉴定。3.将原核表达质粒pET30a-LRP4胞内区转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达蛋白,收集并纯化,进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。4.以SNX17基因为模板设计引物,从pET30a-SNX17扩增出SNX17基因。5.利用分子克隆技术等方法,构建pEASY-Blunt M2-SNX17真核表达质粒。6.将真核表达质粒pEASY-Blunt M2-SNX17转染HEK293细胞,提取总蛋白,进行SDS-PAGE电泳和Western blot的鉴定。7.通过抗His单克隆抗体磁珠以及抗Myc单克隆抗体磁珠进行双向Co-IP,Western blot的鉴定。结果1.限制性内切酶双酶切和测序分析均表明原核表达质粒pET30a(+)-LRP4胞内区及真核表达质粒pEASY-Blunt M2-SNX17构建成功。2.经过SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定,构建的pET30a(+)-LRP4胞内区的原核表达质粒转化BL21(DE3)成功,成功诱导表达His-LRP4胞内区蛋白,分子量约17.8Kd。3.经过SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定,构建的pEASY-Blunt M2-SNX17真核表达质粒的转染细胞后表达Myc-SNX17蛋白,分子量约53Kd。4.抗His单克隆抗体磁珠可通过His-LRP4胞内区蛋白将Myc-SNX17沉淀出来。5.抗Myc单克隆抗体磁珠可通过Myc-SNX17将His-LRP4胞内区沉淀出来。结论1.LRP4胞内区与SNX17直接发生相互作用。2.SNX17可能通过与LRP4结合,诱导LRP4肌细胞内的循环再利用,募集nAChR,修复受损的NMJ。