研究背景及目的二甲双胍(Metformin)是应用于治疗2型糖尿病的小分子双胍类化合物。近期,研究人员发现二甲双胍可以降低糖尿病患者的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的发病风险。经体内和体外实验证实了二甲双胍对OSCC细胞具有一定的抑制作用。另外,将二甲双胍与抗口腔癌化疗药物联合使用,可增强化疗药物对OSCC细胞的毒性作用。因此推测,二甲双胍对临床OSCC患者具有一定的治疗前景。Yes结构结合蛋白(Yes-associated protein,YAP),基因位置为11q22,作为Hippo信号通路中的转录共激活因子,参与调节OSCC细胞的增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移等各项生物学行为。研究表明,YAP蛋白功能被激活,可以通过加快OSCC细胞的周期进展并抑制细胞凋亡,进而促进OSCC细胞的增殖;也可以促进细胞上皮间充质转化,促进OSCC细胞的侵袭性;还可以促进OSCC细胞对抗癌药物的耐药性。此外,OSCC细胞内高表达的YAP蛋白量与OSCC癌症的恶变呈正相关。而本课题组之前的研究证明,YAP转运到细胞核中,与相应的转录因子相结合,从而驱动c-myc和bcl-2基因的转录翻译,进而减少OSCC细胞的凋亡并促进OSCC细胞的增殖。并且,利用维替泊芬抑制OSCC细胞中YAP蛋白表达,可以抑制OSCC细胞的增殖和侵袭。因此推测,YAP可作为OSCC潜在的致癌因子和抗癌靶点。综上,本研究通过验证二甲双胍是否可以抑制OSCC细胞内YAP蛋白的表达,并探究二甲双胍与OSCC细胞内的YAP蛋白作用关系,进而为二甲双胍作为抗OSCC治疗药物提供分子机制理论依据,也为OSCC化疗药物的筛选提供选择。方法1 用 Ommol/L、5mmol/L、15mmol/L 和 30mmol/L 浓度的二甲双胍处理 CAL27和SCC25细胞,利用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测24h、48h和72h后CAL27和SCC25细胞增殖活性的大小,利用流式细胞仪检测24h后CAL27和SCC25细胞周期和凋亡的改变。2 用 Ommol/L、5mmol/L、15mmol/L 和 30mmol/L 浓度的二甲双胍处理 CAL27和SCC25细胞,24h后提取CAL27和SCC25细胞总蛋白,利用蛋白印迹法检测MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、MOB1、SAV1、YAP、p-YAP、mTOR、p-mTOR、CDK4、CDK6、p21、BCL-2 和 BAX 蛋白的表达量。3用过表达YAP基因的慢病毒载体构建过表达YAP的CAL27和SCC25细胞株,慢病毒转染72h后,提取CAL27和SCC25细胞总蛋白和总RNA,蛋白印迹法和实时荧光定量PCR检测过表达效率。4设置对照组、二甲双胍组、过表达YAP组和过表达YAP加二甲双胍组。药物处理时间为24h,CCK-8细胞活性检测试剂盒检测各组细胞增殖活性改变,流式细胞仪检测各组细胞周期和凋亡改变。蛋白免疫印迹法检测各组细胞内mTOR、p-mTOR、CDK4、CDK6、BCL-2 和 BAX 蛋白的表达量。5设置对照组、二甲双胍组、维替泊芬组,维替泊芬联合二甲双胍组。药物处理时间为24h,流逝细胞仪检测各组细胞周期和凋亡的改变。蛋白免疫印迹法检测各组细胞内mTOR、p-mTOR、CDK4、CDK6、BCL-2和BAX蛋白的表达量。结果1 CAL27和SCC25细胞的增殖活性随药物浓度的升高而降低,但细胞G1期阻滞、细胞早期和晚期凋亡的比例随二甲双胍药物浓度的增加而增加,数据差异具有统计学意义。同时,CAL27和SCC25细胞内CDK4、CDK6、BCL-2蛋白表达减低,p21和BAX蛋白表达增多。2 CAL27和SCC25细胞内Hippo信号上游表达因子p-MST1、p-LATS1、MOB1和SAV1蛋白表达随二甲双胍药物浓度的增加而升高。同时,YAP蛋白磷酸化修饰增多,非磷酸化修饰的YAP蛋白减少,mTOR、p-mTOR和C-MYC蛋白的表达随二甲双胍药物浓度的增加而减低。3过表达YAP加二甲双胍组CAL27和SCC25细胞的增殖活性较二甲双胍组高,但细胞G1期阻滞、细胞早期和晚期凋亡的比例较二甲双胍组低,数据差异具有统计学意义。同时,过表达YAP加二甲双胍组CAL27和SCC25细胞内CDK4、CDK6、BCL-2蛋白表达比二甲双胍组高。4维替泊芬联合二甲双胍组中CAL27和SCC25细胞G1期阻滞、细胞早期和晚期凋亡的比例较二甲双胍组高,差异具有统计学意义。同时,维替泊芬联合二甲双胍组中CAL27和SCC25细胞内CDK4、CDK6、BCL-2蛋白表达较二甲双胍组低。5促进YAP蛋白表达可以削弱二甲双胍对CAL27和SCC25细胞内mTOR、p-mTOR和C-MYC蛋白的抑制作用;但抑制YAP蛋白活性可以促进二甲双胍对CAL27和SCC25细胞内mTOR、p-mTOR和C-MYC蛋白的抑制作用。结论本研究证明二甲双胍可以通过抑制OSCC细胞内YAP蛋白的表达,促进OSCC细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡,使OSCC细胞增殖活性降低。同时,YAP蛋白还参与二甲双胍对OSCC细胞内mTOR、p-mTOR和C-MYC蛋白的调节作用。