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本课题的研究目标是对流感病毒血凝素转位结构域（HA2）进行截短和突变，筛选获得长度最短、转位功能较强的HA2优化短肽，用于靶向促凋亡分子的构建。在本课题组前期的工作中，已将HA2引入到靶向促凋亡分子中，体内外实验证实其具有转位活性，能够促进杀伤效应分子从内吞体转位到胞浆，增强抗肿瘤作用。在此基础上，本研究对HA2进行改构优化，设计获得了6种截短体和3种突变体，通过体外红细胞溶解实验、肿瘤细胞杀伤实验和荧光共振能量转移实验（FRET）比较这些HA2截短体/突变体的转位功能强弱。首先，我们利用体外红细胞溶解实验对HA2改构体进行功能筛选，如果破坏红细胞膜的能力越强，就会导致上清中血红蛋白含量越高，表明HA2改构体的转位功能越强。以野生型HA2作为对照，将合成的上述9种HA2截短体/突变体与分离的人外周血红细胞相孵育。剂量效应实验和时间效应实验的结果均表明，在相同条件下E5C3的溶血能力强于HA2，E5弱于HA2，并且呈现出时间依赖关系和某种程度的剂量依赖关系。羧基端的3个截短体C3、C15、C8中，仅C3具有溶血能力，提示HA2的2个螺旋区对于溶血功能至关重要，去掉一个或两个均会使HA2丧失溶血功能。氨基端的2个截短体N15和N3均丧失了溶血活性，说明氨基端第一个氨基酸的重要性，与文献报道一致。而中间截短体M7、E5C3M7在增大剂量或延长时间时，其溶血百分率均远远低于HA2，表明中间氨基酸残基可能对HA2的溶血功能有贡献。通过体外红细胞溶解实验，我们选出5个HA2截短体/突变体进行下一步细胞内的功能筛选，其中HA2作为阳性对照，E5C3的转位功能明确、强于HA2，C15、M7、E5C3M7的转位功能微弱，远低于HA2。其次，利用肿瘤细胞杀伤实验对HA2改构体进行功能筛选。将HA2截短体/突变体引入本组前期构建的其中一种靶向促凋亡分子中，如果这些重组分子对肿瘤细胞的杀伤作用越强，就表明HA2改构体的转位功能越强。本研究构建了5种e23sFv-Fdt-HA2截短体/突变体-tBid，分别转染两种HER2阳性乳腺癌细胞BT474和SKBR3，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明，E5C3的转位效率强于野生型HA2；E5C3M7、C15、M7的转位效率弱于HA2。最后，利用FRET实验对HA2改构体进行功能筛选。将HA2截短体/突变体插入EGFP（FRET供体）和mCherry（FRET受体）之间，构建HBsAg靶向的融合指示分子，如果FRET信号丢失越多、mCherry弥散分布的程度越高，就表明HA2改构体的转位功能越强。构建了5种scFv15-EGFP-Fdt-HA2截短体/突变体-mCherry，稳定转染COS7细胞并建系，预实验显示COS7细胞分泌表达的scFv15-EGFP-Fdt-HA2-mCherry可内化进入乙肝表面抗原（HBsAg）阳性肝癌细胞PLC/PRF5中，并且呈内吞体颗粒状分布，为进一步优化FRET检测窗口、分析mCherry亚细胞分布比率提供了初步的实验依据。经过上述实验验证，HA2的突变截短体E5C3具有更强的转位功能，为下一步将其应用于靶向促凋亡分子奠定了基础。