神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是指未分化的神经细胞，它应该具有自我更新能力，并能产生组成中枢神经系统的三种主要细胞：神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，亦即具有多分化潜能。长久以来，人们一直认为成年哺乳动物中枢神经系统(central nervous system，CNS)内并不存在具有自我更新能力的干细胞，然而，近来有多项实验证据向这一固有观念提出了挑战，体内、体外研究提示成年动物脑内确实存在具有自我更新能力并能产生分化后代的细胞。同时，在哺乳动物(包括人类)脑内的某些特殊区域(如嗅泡和海马)神经发生可一直持续到成年。这一新的发现使人们对成年哺乳动物脑内的神经再生及NSCs产生了浓厚的兴趣并引起了热烈的讨论：既然成年哺乳动物脑内存在神经干细胞且某些特殊区域神经发生一直持续到成年，那么为什么成年动物中枢神经系统损伤后的自身修复却又如此困难呢?实际上，在成年动物脑内，具有神经干细胞样特性的细胞几乎存在于整个中枢神经系统，但在体条件下这些细胞只有在几个有限的区域分化形成神经元，例如侧脑室壁的室下带及海马齿状回的颗粒下层。成年哺乳动物中枢神经系统可怜的再生能力可能主要归结于两方面的原因：第一，成年动物中枢神经系统内的大多数区域存在一些特殊的微环境因素，它们抑制了内源性神经干细胞向神经元方向的分化；第二，内源性神经干细胞的数量太少，不足以形成有效的自我修复。要克服这些困难，最重要的是要进行更深一步的 第四军医大学硕士学位论文一研究，以阐明神经干细胞自我更新及分化的调节机制，只有如此，才能揭示成年哺乳动物脑内如何抑制了自身修复性的神经再生，从而能更进一步活化内源性的神经干细胞或控制移植的外源性神经干细胞的分化，达到临床治疗的目的。 由于动物脑内微环境异常复杂，如需研究神经干细胞的分化机制，最好将神经干细胞在体外增殖培养。目前己建立的神经干细胞培养方法主要有三种：1．以‘、eurosphere”形成为基本特征的 NSCs克隆增殖方法，这种方法的培养过程因可观察到培养细胞的自我更新及多分化潜能特性，本身即可定义神经干细胞，同时，应用这种方法可使NSCS在体外以未分化状态增殖，从而可得到大量的细胞以用于后续研究；2．克隆单层培养方法，这种方法并不是用于NSCS的体外增殖，而是用于分析单个NSCS的分化潜能谱系研究；3．切片培养法，应用这种方法，可以在尽量接近体内环境的条件下研究NSCS在胚胎大脑皮质发育中的形态与作用。本次实验的目的主要是观察神经干细胞在体外因素刺激下的分化情况，因此采用Reyllolds的“Neurospheres”特殊培养条件来进行胚胎大鼠神经干细胞的培养及鉴定。 以往的研究表明，p－疏基乙醇（p－mercaptoethanol，BME）作为一种抗氧化剂，可诱导中胚层来源的骨髓间质细胞向神经元方向特异性分化使其表现出神经元的特有形态（如折光性的胞体，长的突起及突起末端的生长锥及丝状伪足），并表达NSE、NFM、NeuN、au等神经元特异性分于，在整个分化过程中，还观察到了短暂的nestin抗原的表达。然而，BME对神经干细胞的诱导分化作用目前尚无报道，且其诱导细胞分化的分于机制不清楚，本次实验拟采用这种新的诱导因素来观察其对神经干细胞分化的影响。但以往研究显示，10巧0 P M／L的 BME浓度比较适合神经元的生长，而在 Wodb［Jry等人诱导骨髓间质细胞向神经元分化过程中，其所用BME浓度为16（在诱导过程中有细胞脱落、死亡现象），两者之间差距较大，究竟哪一个 －3－ 第四军医大学硕士学位论文一浓度更利于神经干细胞的增殖分化仍需进一步确定。 基于以上考虑，本实验利用倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪等实验仪器，采用免疫荧光法、免疫细胞化学方法、流式细胞检测技术、MTT Lh色检测技术，并借助二疏基乙醇（卜mercaptal ethanol，BME）作为诱导干预因素，从胚胎大鼠脑室下区分离培养、鉴定神经干细胞，并观察其向神经元的自然分化及BME诱导分化情况，试图为阐明神经干细胞的分化机制提供一条新的思路。本次实验所得结果如下： 门）培养的细胞克隆呈nestin表达阳性，倒置显微镜下可见克隆球贴壁分化后有神经元样、星形胶质样、少突胶质样细胞出现在克隆球周围，兔疫细胞化学染色可见NSE、GFAP、GalC阳性神经细胞出现。 （2）在自然分化条件下，神经干细胞球分化 8天后 nestin阳性细胞比例为 10．9％，NSE阳性细胞比例为 31．6％。 （3）对照组、10卜M处理组、100卜M处理组、500卜M处理组MTT检测细胞活性的OD值分别为0．084士0刀26、0．083土0刀30、0．087士0刀29、0刀44土0．010，而lmM处理组和smM处理组则在诱导分化24h内绝大部分细胞裂解死亡。 （4）mo V M处理组诱导神经干细胞球分化吕天后NsE阳性细胞比例为32．3％。 本次实验结论如下：