外源海藻糖对水稻耐盐性的影响及OsTPP1基因在盐胁迫下的功能分析

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水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一,是全世界50%以上人口的口粮供给来源。随着全球气候变化及生态环境恶化,盐渍化土地面积逐渐增加,大大减少了可耕作田地,为提高水稻产量带来了巨大阻碍。水稻是盐敏感作物,挖掘、研究水稻的耐盐基因,了解水稻耐盐机制,培育耐盐水稻品种,对提高水稻在盐渍化土地中的产量具有十分重要的意义。海藻糖(Trehalose)是生物体内广泛存在的一种非还原性双糖,研究发现海藻糖在植物应对盐胁迫方面发挥了重要作用。本研究以4个水稻品种龙稻5、东农425、龙粳46、松粳9为试验材料,研究外源喷施海藻糖对盐胁迫下不同水稻品种幼苗生长的影响。以水稻海藻糖-6-磷酸磷酸酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)家族基因OsTPP1为研究对象,对其过量表达和基因敲除株系进行盐胁迫处理,研究转基因株系生理指标和农艺性状在盐胁迫下的变化规律,解析OsTPP1在盐胁迫下的功能,主要研究结果如下:1.在同等盐浓度胁迫下,4个品种的形态指标和生物量都有所下降,但是下降幅度不同。龙稻5各项指标降幅最小,东农425和龙粳46次之,松粳9各项指标降幅最大,因此龙稻5为苗期耐盐品种,松粳9为苗期盐敏感品种。外源喷施不同浓度的海藻糖使各品种的幼苗存活率、苗高、根数、根长、根鲜重、根干重、地上部鲜重与对照相比均有所增长,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加,可溶性蛋白(SP)和海藻糖含量增加,丙二醛(MDA)含量降低。大部分指标均在外源海藻糖浓度为15 mmol/L时达到极值,说明叶面喷施15 mmol/L海藻糖能有效缓解盐胁迫对水稻幼苗的伤害。海藻糖对盐胁迫下松粳9缓解效果显著优于其他三个品种,说明外源海藻糖应用于盐敏感品种时效果更加。2.为了验证OsTPP1基因的表达模式,以野生型日本晴为材料,对不同组织部位和不同时期进行qRT-PCR分析发现,OsTPP1在水稻根、茎、叶片、叶鞘、穗和籽粒均有表达,但在茎和叶片中的表达量最高。盐胁迫后,OsTPP1在孕穗期、开花期、灌浆期和完熟期持续上调表达,其中,在茎中抽穗期表达量最高,在叶中灌浆期表达量最高。亚细胞定位结果表明,OsTPP1基因主要在水稻细胞质和细胞核中表达。3.从OsTPP1过表达和CRISPR/Cas9基因编辑敲除系中分别筛选出两个纯合株系。在水稻孕穗期对过表达株系、敲除株系和野生型进行盐胁迫处理,结果表明,过表达和敲除OsTPP1基因对Na+含量、K+含量、株高(PH)、每穗粒数(SPP)、结实率(PRG)、丙二醛(MDA)影响不大。过表达株系在盐胁迫下的脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)含量显著增加,抽穗时间(DTH)显著减少,分蘖数(PPP)和千粒重(TGW)显著增加,而敲除株系则相反,说明OsTPP1可以显著增加盐胁迫下脯氨酸和可溶性糖含量,减少盐胁迫下水稻的生育期,增加分蘖数和千粒重,进而提高水稻产量。过表达和敲除OsTPP1株系中海藻糖含量与野生型相比没有产生明显的差异,说明转OsTPP1基因并不能显著影响水稻体内海藻糖含量的变化。4.以过表达株系OE-A和OE-B为材料,分析海藻糖TPS(海藻糖-6-磷酸合酶,trehalose-6-phosphate synthase)和TPP家族其他基因的表达量,发现OsTPS1、OsTPS5、OsTPS8、OsTPS9和OsTPP6等5个基因表达量上升,说明OsTPP1可以诱导上述基因的表达,暗示OsTPP1可能与它们互作来提高水稻的耐盐性。
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