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在胚胎早期发育过程中,染色体会经历广泛的表观遗传修饰的变化,如DNA去甲基化和重新甲基化,组蛋白的去甲基化和重新甲基化,以及组蛋白去乙酰化和乙酰化等等。胚胎早期发育过程中表观遗传修饰变化异常,会导致胚胎发育异常,甚至引起流产和出生后的异常发育。体细胞核移植(SCNT)可以使高度分化的体细胞重新编程,发育成新的个体,这种技术在农业,生物医药产业和濒危物种保护业拥有巨大的潜力。但是体细胞重编程的不完全导致克隆效率低下,制约着该技术的发展。因此,研究植入前胚胎发育过程中的表观遗传修饰变化对进一步了解胚胎发育机制,提高体外胚胎发育率,提高克隆效率,促进该技术广泛的发展和应用有重要意义。本研究对牛体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎原核时期和植入前发育过程中几个重要的表观修饰进行了检测,对比了体外受精胚胎和核移植胚胎在原核时期和植入前发育过程中的表观遗传修饰的变化;建立了一种简便快捷的将siRNA转入核移植胚胎的电转方式,研究了DNA甲基转移酶1(DNMT1)对牛核移植胚胎体外发育以及表观重编程的影响;还研究了O-GlcNAc糖基化对牛体细胞核移植胚胎体外发育和DNA甲基化重编程的影响。主要研究内容和结果如下:1.利用双重免疫荧光染色技术,对牛体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎原核时期和植入前发育过程中几个重要的表观遗传修饰位点(5-mC,5-hmC,H3K9me2和H3K9me3)进行检测。结果显示,在牛体外受精胚胎原核时期,原核融合前(2hpa-10hpa)雌原核5-mC水平没有显著变化,5-hmC水平逐渐升高,H3K9me3和H3K9me2水平逐渐降低;而雄原核5-mC水平逐步降低,在10hpa达到最低,5-hmC水平逐渐升高,H3K9me3和H3K9me2水平都逐渐降低。原核融合后(16hpa-22hpa)合子的5-mC,5-hmC,H3K9me3和H3K9me2水平都是逐渐升高的。核移植胚胎伪原核的5-mC,H3K9me3和H3K9me2水平具有相似的变化趋势,在2hpa到10hpa逐渐降低,16hpa到22hpa逐渐升高;而5-hmC水平在整个原核时期是逐渐上升的。从2-细胞期到囊胚期,体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎的5-mC,5-hmC和H3K9me3水平变化趋势一致。从2-细胞期到8-细胞期逐渐降低,8-细胞期表达最低,桑葚胚期到囊胚期逐渐升高;体外受精胚胎H3K9me2水平在2-细胞到8-细胞时期较弱,桑葚胚期到囊胚期逐渐升高;而核移植胚胎H3K9me2水平在2-细胞期较弱,从4-细胞期到囊胚期逐渐升高。说明在牛体外受精胚胎和核移植胚胎原核时期开始就存在广泛的表观遗传重编程。2对比牛体外受精胚胎和核移植胚胎在原核时期和植入前发育过程中的表观遗传修饰水平。结果显示在体外受精胚胎和核移植胚胎原核时期22hpa时,核移植胚胎存在异常高的5-mC和H3K9me3水平,而5-hmC和H3K9me2水平异常低。在2-细胞到囊胚期,核移植胚胎5-mC,5-hmC和H3K9me2水平显著高于体外受精胚胎,5-mC水平在2-细胞期到桑葚胚期差异显著,5-hmC水平在2-细胞期到8-细胞期以及囊胚期差异显著,H3K9me2水平在4细胞期到囊胚期差异显著,其他时期差异不显著。核移植胚胎H3K9me3水平在2-细胞到8-细胞时期显著高于体外受精胚胎,桑葚胚期和囊胚期显著低于体外受精胚胎。以上结果说明核移植胚胎存在不同程度的表观遗传修饰的异常,过高的5-mC,5-hmC,H3K9me2水平以及H3K9me3的表达异常都可能导致胚胎发育异常。3.建立了一种简便快捷的将siRNA转入核移植胚胎的电转方式。4.研究了干扰DNMT1对核移植胚胎体外发育和重编程的影响。结果显示将siRNA转入到核移植胚胎后,DNMT1的mRNA水平和蛋白水平发生了显著下降,mRNA水平在2-细胞期到8细胞期差异显著,蛋白水平在4-细胞期和8-细胞期差异显著,其他时期差异不显著。对DNMT1进行干扰后,胚胎4细胞和8-细胞期的5-mC水平显著降低,但是发育率没有显著变化。干扰DNMT1的表达可以在一定程度上改善核移植胚胎异常的DNA甲基化水平,但是对胚胎体外发育率没有显著影响。5.研究了通过DON或PUGNAc处理改变O-GlcNAc糖基化水平对牛体细胞核移植胚胎发育及重编程的影响。结果显示,高浓度或者长时间DON或PUGNAc处理会抑制胚胎发育,导致囊胚率降低。25nM DON处理24h能够显著提高胚胎卵裂率和囊胚率,降低囊胚细胞凋亡率,增加囊胚内细胞团比率,提高胚胎体外发育能力,同时还显著提高核移植胚胎原核时期5-hmC水平和降低5-mC水平,并且DON处理组胚胎在2-细胞到桑葚胚期间的5-mC水平同样发生显著降低,但5-hmC水平则没有显著变化。100nM PUGNAc处理24h对于胚胎体外发育率以及原核时期和2-细胞到囊胚期的5-mC和5-hmC水平都没有显著影响。以上结果说明,糖基化的动态平衡在胚胎发育过程中起重要作用,长时间处理打破了这种平衡,导致胚胎发育率降低。短时间的DON处理能够一定程度上修复核移植胚胎原核时期异常的表观遗传修饰,调节胚胎发育过程中基因表达,促进重编程。