背景TRPC通道是瞬时受体电位中第一类被发现的通道,该通道和果蝇的TRP通道的同源性最高,因此又被称为传统型TRP通道。TRPC亚家族不同成员其分布不同,其被激活后发挥的功能也不同。TRPC通道参与转录因子的激活、心肌肥厚以及血小板激活等多种生理病理过程。TRPC1是最早被克隆哺乳类瞬时受体电位通道之一,其分布广泛,在脑、心脏、肾脏、肺、骨骼肌、睾丸、卵巢、唾液腺都有较高水平的表达。目前研究证明:TRPC1不仅参与受体介导,而且在钙依赖的分泌和收缩过程也有重要作用。而胸主动脉平滑肌组织中TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用强度的变化以及TRPC1、TRPC4和TRPC5在胸主动脉平滑肌收缩中的作用目前仍不清楚。目的研究胸主动脉平滑肌组织TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用强度的变化,另外,本实验同时研究了TRPC1、TRPC4和TRPC5在胸主动脉平滑肌收缩中的作用。方法1瞬时转染si RNA将特异性TRPC1 siRNA转染到胸主动脉,24 h后将胸主动脉进行后续实验。2离体胸主动脉制备以及张力测定离体胸主动脉迅速放进Krebs溶液中等距分为等长血管(长度约2 mm),两端固定在微血管张力测定仪器中,用分析软件数据采集和分析胸主动脉收缩能力。3免疫共沉淀使用TRPC1、TRPC4和TRPC5抗体分别相互共沉淀,检测胸主动脉平滑肌组织TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用强度的变化。结果1在胸主动脉张力实验中,TRPC1 si RNA处理后的胸主动脉平滑肌中TRPC1蛋白表达明显降低,而且,内皮素1引起的收缩较对照组显著增强。2在胸主动脉张力实验中,TRPC4 si RNA处理后的胸主动脉平滑肌中TRPC4蛋白表达明显降低,而且,内皮素1引起的收缩较对照组显著减弱。3在胸主动脉张力实验中,TRPC5 si RNA处理后的胸主动脉平滑肌中TRPC5蛋白表达明显降低,而且,内皮素1引起的收缩较对照组显著增强。4在免疫共沉淀中,TRPC1可以共沉淀TRPC4、TRPC5和BKCa,TRPC4可以共沉淀TRPC1,TRPC5可以共沉淀TRPC1、BKCa,但TRPC4不能共沉淀TRPC5。结论TRPC1分别和TRPC4、TRPC5形成异聚体通道,并且TRPC1、TRPC5和BKCa形成钙信号复合物调节血管平滑肌收缩。背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其严重影响妇女身心健康,甚至危及患者生命,在欧美国家,乳腺癌的发病率高居女性恶性肿瘤首位,虽然我国属低发地区,但是其发病率呈现逐年上升趋势。乳腺癌主要是由于乳腺导管上皮发生恶性改变而产生,表现为乳腺肿痛、有肿块等。目前,乳腺癌的治疗包括五大块:分别是手术治疗、化疗、内分泌治疗、放疗和分子靶向治疗。分子生物学的发展和对发病机制从细胞、分子水平的深入认识,使得肿瘤治疗进入了一个新的分子靶向治疗的时代。与化疗、放疗相比,分子靶向治疗高效、选择性地杀伤肿瘤细胞,使得治疗更有针对性且副作用小。目前,靶向递送si RNA到特定的细胞在药物研发领域有很大的潜力,si RNA不仅可以作为一个研究工具来抑制靶基因的表达,同时也可作为一种治疗方法治疗各种疾病。为了靶向递送si RNA,我们设计了一种靶向肽,该小肽可以包裹si RNA并形成纳米粒子来递送si RNA到乳腺癌细胞,这种靶向性纳米粒子不仅能够通过乳腺癌细胞表面受体靶向递送si RNA并且对正常细胞损坏很小,这一特性大大提高了这项技术的实用性。目的本研究中,我们利用课题组合成的多肽1包裹siRNA形成超分子纳米粒子,从而实现特异性地递送TRPC1 si RNA到乳腺癌细胞中。此外,我们用此靶向肽递送TRPC1 si RNA也能够引起乳腺癌细胞的凋亡。方法1乳腺癌细胞培养乳腺癌细胞MDA-MB-231采用DMEM培养基培养,培养基中添加有10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素、100 g/m L链霉素,在37摄氏度,5%CO2培养箱中培养。2多肽1/si RNA结合能力测试用不同浓度比的多肽1与si RNA进行凝胶阻滞分析测试。并且用肝素(去聚阴离子复合物稳定剂)作用于该复合物,观察结果。3多肽1/si RNA复合物稳定性试验检测多肽1/si RNA复合物在RNA核酸酶和小鼠血清孵育环境下的稳定性,同时用肝素释放si RNA后用凝胶阻滞分析测试si RNA的稳定性。4乳腺癌细胞凋亡实验研究通过Western blot检测用多肽1/si RNA复合物转染后凋亡标签蛋白Bax的表达变化,并与对照组进行比较,观察多肽1/si RNA复合物的优劣势。5乳腺癌细胞特异性基因体外沉默实验通过Western blot检测用多肽1/si RNA复合物转染后TRPC1的表达变化,并与对照组进行比较,观察多肽1/si RNA复合物的优劣势。6统计学处理所有实验数据均以平均值±标准误表示并运用Sigma Plot 12.5软件进行非配对t检验,P<0.05时认为两组之间的差异具有统计学意义。结果1当多肽1与si RNA比例大于100:1时,多肽1和si RNA结合能力逐渐增强。2在含有核酸酶的溶液中多肽1/si RNA复合物较裸露si RNA的稳定性明显提高。3在小鼠血清中多肽1/si RNA复合物较裸露si RNA的稳定性明显提高。4多肽1/TRPC1 si RNA复合物导入乳腺癌细胞有促凋亡的效应。5多肽1/TRPC1 si RNA复合物导入乳腺癌细胞有抑制TRPC1表达的作用。结论本实验验证了我们课题组新合成的多肽1导入TRPC1 si RNA的可行性,为si RNA治疗乳腺癌提供潜在新的理论依据和方法。