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第一部分:CYP24A1参与炎症因子调控Wnt信号通路的机制研究目的:CYP24A1编码1,25-双羟维生素D3特异性代谢酶,对1,25-双羟维生素D3局部组织浓度有决定性影响,后者能够下调Wnt/β-catenin通路活化程度。CYP24A1在结肠息肉与结肠癌中有异常高表达,其SNP分布也与溃疡性结肠炎发病相关。细胞因子IL-6和TNF-α的活化和NF-κB通路的激活在炎癌转化过程中起到关键作用,本课题组前期研究发现IL-6和TNF-α可通过NF-κB通路调控Wnt/β-catenin通路活化。有研究报道,IL-6和TNF-α能够诱导CYP24A1转录增多,但对蛋白含量影响尚不明确,且CYP24A1基因的表达调控是否参与IL-6或TNF-α通过NF-κB通路调控Wnt/β-catenin通路活化尚无相关研究。本研究旨在探讨CYP24A1在IL-6和TNF-α通过NF-κB通路调控Wnt通路过程中的作用,进一步明确炎症与肿瘤发生之间的关系与具体机制,为特异性抑制CYP24A1酶活性、增加结肠组织对1,25-双羟维生素D3抑癌作用敏感性在预防UC癌变中的应用提供了研究基础。方法:本研究将细胞因子IL-6和TNF-α作用于结肠癌细胞株HCT-116、Caco-2,使用Western Blot检测对CYP24A1蛋白表达的影响,使用凝胶迁移实验(EMSA)检测对NF-κB通路活化程度的影响,使用Western Blot检测NF-κB通路特异性抑制剂PDTC对IL-6和TNF-α诱导CYP24A1表达的影响;利用siRNA敲减CYP24A1表达后,双荧光素酶报告基因实验检测IL-6和TNF-α对Wnt信号通路调控作用的变化,使用Western Blot检测细胞核β-catenin蛋白水平。结果:IL-6与TNF-α作用于Caco-2和HCT-116细胞可使CYP24A1表达量增加,且表现为时间、剂量依赖。在Caco-2细胞系选取IL-6 100ng/ml、TNF-α50ng/ml 分别作用 6h,HCT-116 细胞系选取 IL-6 50ng/ml、TNF-α100ng/ml 分别作用6h,NF-κB通路活化程度增加,使用NF-κB通路特异性抑制剂PDTC可明显抑制IL-6与TNF-α对CYP24A1表达的诱导作用。利用siRNA敲减CYP24A1表达可部分拮抗IL-6和TNF-α诱导的β-catenin核内分布增多以及Wnt通路活化(相对荧光素酶活性Caco-2细胞系IL-6 3.297±0.1610 vs 2.527±0.03323,p=0.0221;TNF-α 4.130±0.4289 vs 2.780±0.3092,p=0.0249;HCT116 细胞系 IL-6 1.357±0.03422 vs1.086±0.07545,p=0.0048;TNF-α2.374±0.1955 vs 1.802±0.06163,p=0.0313)。结论:在Caco-2和HCT-116细胞系中,IL-6和TNF-α可能通过诱导NF-κB通路活化进一步促进CYP24A1表达量增加,促进核内β-catenin增多,上调Wnt通路活化程度。第二部分:溃疡性结肠炎癌变模型小鼠中CYP24A1基因表达与炎症因子的关系目的:本实验通过建立AOM联合DSS小鼠UC癌变模型,给予阻断炎症因子TNF-α、NF-κB处理,探究炎症相关途径在UC癌变中对CYP24A1表达的影响。方法:将C57BL/6小鼠随机分为4组,第1组为空白对照组,第2-4组建立UC癌变小鼠模型(腹腔注射12.5mg/kg AOM,1周后给予2.5%DSS的饮用水,连续5天,之后换成普通饮用水),其中,第2组为模型对照组,第3组给予NF-κB反义寡聚核苷酸每两周一次灌肠,第4组给予TNF-α单克隆抗体每两周一次腹腔注射。12周后处死小鼠,统计瘤负荷,进行病理学评估,使用免疫组化方法检测CYP24A1表达情况。结果:CYP24A1表达在模型对照组(n=8,2.500±0.3273)中较空白组(n=6,1.167±0.1667)升高(p=0.0067)。NF-κB反义寡聚核苷酸组的瘤负荷(n=5,1.130±0.1678cm)较模型对照组(n=8,2.294±0.3638 cm)显著下降,差异有统计学意义(p= 0.0354);NF-κB反义寡聚核苷酸组的小鼠结肠上皮细胞中CYP24A1表达水平显著下降(1.400 ±0.2449 vs 2.500 ± 0.3273,p=0.0362)。TNF-α单克隆抗体组的瘤负荷(n=5,1.780±0.5142)较模型对照组(n=8,2.294±0.3638)有下降趋势,但差异无统计学意义(p= 0.4195);TNF-α单克隆抗体组CYP24A1表达水平显著下降(1.167 ±0.1667 vs 2.500 ±0.3273,p=0.0144)。结论:AOM/DSS诱导的UC癌变的小鼠模型中CYP24A1表达升高,抑制TNF-α、NF-κB可部分逆转该作用。