研究背景脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是遗传性精神发育迟缓的主要病因之一,在染色体异常所致的智力低下综合征中患病率仅次于Down综合征。FXS主要临床特征包括:智力障碍、语言障碍、行为异常和癫痫等,部分病人有巨睾和特殊面容。癫痫发作是FXS神经系统常见表现,据报道20%～25%的脆性X综合征患者发生癫痫[1, 2],而阵发的脑电图异常则高达50%[3]。脆性X综合征是由FMR1基因5’端(CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增及其相邻部位CpG岛异常甲基化,其编码产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)减少或缺失所致,目前已证实FMRP是一种mRNA结合蛋白,主要起mRNA翻译抑制作用,从而对蛋白起到负性调控的作用,但FMRP缺失导致各种临床表型的分子机制尚不明确。FMR1基因敲除(FMR1 KO)鼠几乎表现了脆性X综合征病人的所有表型。听源性惊厥是主要特点之一[4, 5],有报道在杏仁核点燃的癫痫模型上,FMR1 KO鼠较野生(WT)鼠癫痫更易被点燃,苔藓样纤维明显增加[6];我们前期研究中发现FMR1 KO鼠较WT鼠更具热性惊厥易感性,主要表现为热诱导惊厥持续时间长。FMR1 KO鼠因此被认为是一个有效的癫痫或痫性发作的模型。遗传性智能低下疾病常伴有癫痫,应用FMR1 KO鼠这一单基因疾病模型研究遗传因素导致的癫痫生物学特征以及发生机制,可能为该类疾病发病机制的研究提供一个新的思路。正常的神经生理活动是神经环路上兴奋和抑制的平衡。神经元环路中,中间神经元(即GABA能神经元,γ-aminobutyric acid,GABA)是主要的抑制性神经元,目前一般认为谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)是GABA能神经元的直接标记物,GAD只在GABA能神经元中表达。近年来对癫痫实验动物学、临床癫痫病学、癫痫遗传学、癫痫免疫学等领域的研究证实GAD65、GAD67与癫痫密切相关。癫痫的发生是脑内兴奋-抑制失衡的结果,GABA作为中枢神经系统最具代表性的抑制性神经递质,其细胞外浓度的变化在神经元兴奋性的改变、异常放电的过程中起着举足轻重的作用。Marini等也发现GABAA受体基因突变可能是儿童失神性癫痫(CAE)、热性惊厥的原因之一[7]。在动物研究中发现获得性癫痫模型鼠,癫痫后6小时至7天,海马内GABA能神经元持续减少,尤其以癫痫后48小时至7天改变最为明显;癫痫后6小时,大鼠海马GABAA受体α5(γ-aminobutyric acid A receptorα5 ,GABAARα5)亚单位的表达开始下降, 72小时至7天后, GABAARα5亚单位的表达显著降低[8]。以上这些实验结果都提示GABAA受体的改变可能是癫痫的主要原因。电压门控性钠通道在中枢神经系统中对动作电位的起始和传播起着非常重要的作用,因此成为癫痫发病机制研究中的重点。Frank等用敲除1型钠通道(voltage-gated sodium channels 1.1,SCN1A,NaV1.1)基因的杂合子小鼠成功地制作了婴儿重症肌阵挛癫痫(SME)的动物模型。然而,SCN1A基因功能的降低如何导致大脑神经元过度放电而产生癫痫呢?Frank等进一步在该模型鼠急性分离的海马神经元上记录到GAD标记的双极中间神经元的钠通道电流密度明显减少,而钠通道电流密度在锥体神经元则无明显减少,由此认为GAD标记的双极中间神经元钠通道电流密度明显减少在癫痫的发病中起着十分重要的作用[9]。此外,有学者在敲入无功能的SCN1A基因的癫痫模型小鼠发现NaV1.1集中分布于新皮质以及海马的小白蛋白(parval-bumin,PV)阳性中间神经元的轴突起始段[10]。以上这些研究提示,NaV1.1在单个中间神经元上的表达明显强于单个锥体神经元,这种分布的差异使SCN1A基因敲除鼠钠通道电流的减少在中间神经元更加明显,使得中间神经元的兴奋性降低,从而使得其介导的抑制作用降低。有研究发现FMR1 KO鼠大脑皮层PV阳性神经元(GABA能神经元的一个亚型)的数目明显低于WT鼠[11];FMR1 KO鼠皮层、海马、丘脑、脑干的GABA受体β、δ亚基表达明显减少[12, 13],FMR1 KO鼠海马脑片电生理检测发现,灌注GABAA受体拮抗剂荷苞牡丹碱后,可以引发持久的癫痫样放电[14]。因此,我们推测在GABA能神经元数目、结构或其钠通道的异常,可能在脆性X综合征癫痫易感性的形成机制中起着非常重要的作用。研究目的和内容通过比较FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD、GABAARα5表达的改变,了解GABA能神经元数量和结构变化是否为FMR1 KO鼠癫痫易感的基础。通过比较FMR1 KO鼠和WT鼠海马组织以及GABA能神经元NaV1.1蛋白表达的改变,探讨NaV1.1对FMR1 KO鼠神经元钠电流可能的影响。通过检测FMR1 KO鼠和WT鼠海马中间神经元和锥体神经元钠电流的电生理学变化,从而进一步在功能上探讨抑制性神经元兴奋性改变在FMR1 KO鼠癫痫形成中的作用。研究方法1. FMR1基因敲除鼠模型的鉴定FVB品系小鼠饲养在19～21℃自然光条件下,自由获取食物和水分。选取14-17天龄的FMR1 KO鼠和WT鼠,一般选取雄性小鼠,实验前取尾提取DNA,PCR技术进行基因型鉴定。2.荧光实时定量逆转录PCR检测目标基因的表达量在解剖显微镜下分离海马组织。在玻璃匀浆器中加入海马脑组织和RNAiso Reagent Trizol研磨,提取总RNA。逆转录cDNA后进行荧光实时定量逆转录PCR检测GAD、GABAARα5、NaV1.1和内参GAPDH的mRNA,并进行相对定量分析。3.Western blotting检测目标蛋白表达水平同上方法分离海马组织,提取蛋白后检测蛋白浓度,进行Western blotting。电泳转膜后分别使用GAD、GABAARα5、NaV1.1和内参β-actin的抗体孵育,然后孵育相应二抗,曝光显影后对条带进行定量分析。4.免疫组化和免疫荧光双标检测目标蛋白共表达水平多聚甲醛灌注小鼠,冰冻切片,做GAD细胞免疫组化,统计细胞数目,并孵育GAD和NaV1.1的抗体以及相应二抗,在荧光显微镜下观察, GAD神经元和NaV1.1共表达分析。5.膜片钳检测钠电流特征急性分离海马神经元,分别选取中间神经元和锥体神经元,在全细胞电压钳模式下给予标准刺激方案,根据所得电流数据建立快速钠电流的激活曲线、失活曲线和失活后复活曲线,计算持续钠电流的最大波幅,激活电压和电流密度等进行比较。6.统计学分析计量资料以均数±标准差(x±s)表示,统计方法用SPSSl6.0 for Windows软件包进行统计分析,采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义研究结果1.FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABA能神经元数目和GAD表达的变化FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABA能神经元数目的比较:FMR1 KO鼠海马GABA能神经元80±20.134,WT鼠95.11±14.186,差异具有统计学意义(P=0.007);CA1区FMR1 KO鼠32.24±7.710,WT鼠39.59±6.738,差异具有统计学意义(P=0.002);CA3区FMR1 KO鼠29.94±10.028,WT鼠35.07±6.324差异具有统计学意义(P=0.043);DG区FMR1 KO鼠17.82±5.703, WT鼠20.44±3.545,差异不具有统计学意义(P=0.066);在mRNA水平的比较:FMR1 KO鼠GAD67表达高于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.006)。FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD蛋白水平的比较:FMR1 KO鼠GAD67和GAD65的表达均高于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.000);在mRNA水平的比较:FMR1 KO鼠GAD67表达高于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.006)。2.FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABAARα5表达的变化FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABAARα5蛋白水平的比较:FMR1 KO鼠GABAARα5的表达低于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.000);在mRNA水平的比较:FMR1 KO鼠GABAARα5表达低于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.031)。3. FMR1 KO鼠和WT鼠海马NaV1.1表达的变化FMR1 KO鼠和WT鼠海马NaV1.1蛋白水平的比较:FMR1 KO鼠Nav1.1的表达高于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.000);在mRNA水平的比较:FMR1 KO鼠Nav1.1的表达高于WT鼠,差异具有统计学意义(P=0.000)。4. FMR1 KO鼠和WT鼠海马神经元GAD和NaV1.1共表达Nav1.1通道蛋白在海马区的神经元均有表达:锥体层的锥体神经元和齿状回颗粒层的颗粒细胞胞体(未被GAD标记)上的表达较弱,NaV1.1蛋白在锥体层和颗粒层中散在分布的GAD标记的神经元上却有着比较强的阳性表达。5.海马钠通道电生理特性5.1.钠通道的激活FMR1 KO鼠和WT鼠锥体神经元V0.5与k值分别为:FMR1 KO鼠(n=4): -34.56±2.23(mV),4.43±0.35;WT(n=4): -37.87±2.18(mV),4.69±0.41,差异无统计学意义(P>0.05);FMR1 KO鼠和WT鼠中间神经元:FMR1 KO鼠(n=4): -32.07±2.06(mV),4.38±1.11;WT(n=4): -32.56±1.68(mV),5.02±0.4,差异无统计学意义(P>0.05)。5.2.钠通道的稳态失活FMR1 KO鼠和WT鼠锥体神经元V0.5与k值分别为:FMR1 KO鼠(n=4): -53.14±2.62(mV),5.46±1.14;WT(n=4): -55.86±2.12 (mV),5.68±0.91,差异无统计学意义(P>0.05),图17A所示;FMR1 KO鼠和WT鼠中间神经元V0.5与k值分别为:FMR1 KO鼠(n=4): -55.15±2.99(mV),8.02±1.15;WT(n=4): -54.47±2.44(mV),6.42±1.85,差异无统计学意义(P>0.05)。5.3.钠通道的失活后恢复FMR1 KO鼠和WT鼠锥体神经元恢复时间常数τ值分别为:FMR1 KO鼠(n=4): 6.25±1.66(ms),WT鼠(n=4):6.85±2.09(ms),差异无统计学意义(P>0.05);FMR1 KO鼠和WT鼠中间神经元恢复时间常数τ值分别为:FMR1 KO鼠(n=4):6.79±1.55(ms),WT鼠(n=4): 6.54±2.62(ms),差异无统计学意义(P>0.05)。5.4钠通道电流密度经细胞膜电容标化后,FMR1 KO鼠和WT鼠锥体神经元电流密度为KO(n=4):0.2932±0.106(nA/pF); WT鼠(n=4): 0.1260±0.054 (nA/pF),两者比较差异具有统计学意义(P=0.037);FMR1 KO鼠锥体神经元电流密度高于WT鼠;FMR1 KO鼠和WT鼠中间神经元电流密度为FMR1 KO鼠(n=4):0.2668±0.047(nA/pF); WT鼠(n=4): 0.5163±0.058(nA/pF),两者比较差异具有统计学意义(P=0.044)。结论1.本研究首次发现FMR1 KO鼠海马GABA能神经元数目降低,其抑制性降低可能是导致FMR1 KO鼠癫痫易感性增高的原因之一,也为进一步研究提供了形态学的基础。2.本研究首次发现FMR1 KO鼠海马GABAARα5蛋白表达减少,提示其介导的中间神经元抑制性降低可能是导致FMR1 KO鼠癫痫易感性增高的原因之一。3.本研究首次在FMR1基因敲除小鼠海马组织发现电压门控钠离子通道a亚单位NaVl.1表达水平增高;进一步的电生理研究发现FMR1 KO鼠锥体神经元钠通道兴奋性的增强,中间神经元钠通道兴奋性降低。为FMR1 KO鼠癫痫易感性增高提供了电生理依据。不仅说明NaVl.1表达的增高可能所致是锥体神经元钠通道兴奋性增强的原因,而且为中间神经元抑制性降低导致FMR1 KO鼠癫痫易感性增高提供了电生理依据。在细胞水平中间神经元钠通道兴奋性降低的原因NaVl.1的表达情况及其与电生理的关系待进一步研究。4.本研究显示FMR1基因敲除小鼠海马组织GAD和NaVl.1mRNA和蛋白在转录和翻译水平表达均增高,支持FMRP具有负性调控蛋白表达的作用。