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猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）俗称猪“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus, PRRSV）引起的以怀孕母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道疾病为主要特征的危害世界养猪业的重要疫病。2006年我国南方一些省份的猪场暴发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病，给我国养猪业造成了严重的经济损失。PRRSV进化导致病毒抗原性、嗜性和致病性等表型发生变异，这给临床PRRS的防控带来了巨大的挑战。为了深入理解PRRSV表型变异的分子基础，进而研制出更有效的疫苗，本研究利用真核聚合酶I和II启动子和终止子，结合核酶，构建了PRRSV真核拯救系统；利用慢病毒包装和转导技术建立了稳定表达T7RNA聚合酶的Mark-145细胞系。通过上述不同方法，来试图建立PRRSV体内拯救系统。为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆，根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株（EF635006）和经典PRRSV的CH-1a株（AY032626）全基因组序列，设计并合成特异引物，用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到PMDT-20载体中，建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆，并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果，选择特异的酶切位点，将各个亚克隆产物逐段克隆入经过改造过的低拷贝pOK12载体中，通过引入MluI和EcoR I酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列和榔头锤酶基因（Hammerhead ribozyme, HamRz）置于病毒基因组5’端；通过引入NotI和Fse I酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列和戊型肝炎病毒核酶（Hepatitis delta virusribozyme，HdvRz）基因置于病毒基因组3’端，结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12，该质粒可以利用真核细胞的聚合酶系统转录PRRSV的全长cDNA，也可以利用T7RNA聚合酶系统进行转录。通过直接转染Marc-145细胞来拯救病毒，利用传代培养、RT-PCR等鉴定，没有拯救出感染性病毒。为了建立表达T7RNA聚合酶的Marc-145细胞系，利用T7RNA聚合酶体内拯救病毒，我们利用慢病毒包装和转导技术建立了稳定表达T7RNA聚合酶的Marc-145-T7细胞系。先克隆出T7RNA聚合酶基因，将其定向克隆入慢病毒载体PLVX-puro中，得到阳性重组质粒pLVX-Puro-T7。共转染293T细胞，获得含有T7RNA聚合酶基因的假型病毒。然后将假型病毒感染Marc-145细胞，把T7RNA聚合酶基因整合进Marc-145细胞基因组中。通过G418和嘌呤霉素抗性筛选，获得了稳定表达具有转录活性的Marc-145-T7细胞系，通过PCR、RT-PCR、SDS-PEAG等技术进行鉴定，结果表明，T7RNA聚合酶基因已经被稳定地整合进Marc-145细胞基因组中，并且该细胞系内的T7RNAP具有较好的转录活性，其活性传代不减弱。最后，利用建立的Marc-145-T7细胞系对HP-PRRSV弱毒株全长cDNA分子进行拯救，结果表明，没有获得具有感染性的病毒。虽然没有得到具有感染性的病毒粒子，但是我们从中也收获许多，正确客观地分析没有得到具有感染性的病毒粒子的原因可以为后续试验的改进和优化指明方向。