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真菌的物种概念包括形态学物种,生物学物种和系统学物种,系统学物种是随着真菌群体遗传学的发展而提出的概念,系统学物种概念的提出使得在分子水平研究真菌物种分化的方式成为可能。目前真菌物种分化的方式主要有同地物种形成、异地物种形成以及生态学物种形成几种。其中生态学物种形成是指群体间或单个群体内的亚群体间的生殖隔离种群通过对不同环境或生态位的适应而得到进化,是目前物种形成研究中的一个热点。
捕食线虫真菌弯孢节丛孢(Arthrobotrys musiformis)是圆盘菌属的无性型之一,既能通过分生孢子萌发的方式获得,也能通过子囊孢子萌发的方式获得,同时该无性型也分布在各种异质环境中,多样的生殖方式和广泛的分布使得我们可以用该真菌来研究异质环境对真菌物种分化和有性生殖的影响。本研究以从重金属污染区、盐碱地、高温区和氮磷等污染的底泥等异质环境的土样中,和圆盘菌分离的弯孢节丛孢为研究材料,分析各异质环境对该真菌遗传多样性的影响,并进一步分析该影响对于有性生殖的利弊,也对半知菌缺乏有性生殖的原因进行初步探索。
本文的主要研究结果如下:
1.从四个异质环境和相近地理区域的非异质环境中采集2750份土样,分离到弯孢节丛孢173株;腐木标本的圆盘菌上共分离到弯孢节丛孢12株。
2.分别选取部分来自各个异质环境及其对照环境的菌株进行了常用系统学分析基因ITS、TEF以及RPB2序列的PCR扩增及测序,通过构建三个基因的NJ树发现,几个异质环境中仅来自滇池氮磷等污染环境对弯孢节丛孢的遗传多样性产生了明显的影响,与来自对照环境的菌株明显的位于不同的支系上。同时也发现有一个菌株1.3757所代表的基因型可能是这两种环境的中间类型。
3.为了探索氮磷等污染的环境是促进还是阻碍有性生殖,选择滇池氮磷等污染的环境和对照环境的菌株进一步进行有性生殖相关基因的分析,选取基因为信息素受体pre-1、有性生殖和减数分裂的负调控因子ran1、细胞分化蛋白rcd1以及抑制一般氨基酸控制所需的WD重复蛋白cpc-2。通过构建这四个基因NJ树,发现其结果同上述三个常用系统学分析基因的结果一致,即氮磷等污染环境菌株对四个有性生殖相关基因的分化也产生了影响。菌株1.3757的基因型也表现为中间类型。
4.为了进一步分析氮磷等污染对真菌有性生殖的影响,我们联合比较氮磷等污染的底泥、西山耕作土、圆盘菌分离来的三个群体的菌株的有性生殖相关基因的变化,将具有代表性的核酸序列转译为氨基酸序列,分析氮磷等污染对有性生殖的影响。实验结果显示在pre-1、ran1、rcd1三个基因中,有性型菌株均是部分与滇池氮磷菌株亲缘关系较近,部分与对照环境菌株较近,还有2株与两种环境的中间类型菌株1.3757更为接近;而在cpc-2中,有性型菌株都同氮磷环境菌株聚在一起。通过氨基酸序列的比对分析发现,四个基因的氨基酸序列中,氮磷等污染的菌株在突变点的位置及种类上更接近具备有性生殖能力的菌株,也许这种胁迫环境部分促进了有性生殖。
5.对来自各个胁迫环境极其对照环境的菌株的ITS序列,以及滇池氮磷及其对照环境菌株的四个有性生殖相关基因,分别计算了单倍型多样性(Haplotypediversity),将各个胁迫环境的Hd值与对应对照环境相比较发现,个旧重金属环境、高温环境会使Hd值减小,而高盐环境、会泽重金属环境以及滇池氮磷等环境菌株的Hd值增大。