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禾谷镰孢菌（Fusarium oxysporum,有性态为Gibberella zeae）能引起穗腐、茎腐和根腐病等农作物病害,对农业生产造成巨大的损失。脂肪酶GZEL是由禾谷镰孢菌分泌的一种胞外酶,参与宿主感染过程。目前,GZEL的晶体结构已被解析,但对于该酶的基本酶学性质未见有文献报道。此外,从蛋白三维结构上,已发现GZEL与其他已报道的脂肪酶在结构上最大的区别在于GZEL所独有的C-末端结构,但C-端肽链的详细功能还未被阐明。深入了解该酶的酶学性质并揭示C末端在酶活性发挥中的功能不仅有助于了解酶的结构功能关系,为脂肪酶未来分子改造和工业化应用奠定基础,同时为针对该酶进行由禾谷镰孢菌导致的病害防控均具有重要指导意义。本文以脂肪酶GZEL为研究对象,采用大肠杆菌重组表达技术获得重组表达GZEL,在此基础上,采用传统乳化滴定法和单分子层技术对其酶学性质进行分析;通过设计并构建C-末端肽段缺失突变体,比较分析C-末端肽段缺失前后对脂肪酶GZEL的底物选择性和界面吸附特性的影响作用;结合分子对接模拟及结构分析从分子水平探究其各项性质表现的结构基础。具体研究内容以及结果如下:（1）基于乳化滴定法研究重组脂肪酶GZEL的基本酶学特性。首先,构建了脂肪酶GZEL大肠杆菌重组表达菌株pFL-B62cl-GZEL-Shuffle T7,通过镍柱亲和层析和阴离子交换层析得到了目的蛋白。其次,分别以橄榄油、纯大豆磷脂酰胆碱（PC）、蔗糖酯为底物测定该酶脂肪酶活力、磷脂酶活力、糖酯酶活力发挥的最适反应条件。结果表明:GZEL脂肪酶活性表现的最适反应温度为30-40℃,pH为7.0;磷脂酶活性表现的最适反应温度为45℃,pH为6.0-7.0;糖酯酶活性表现的最适温度为50℃,pH为6.0。其中,脂肪酶GZEL的脂肪酶活性占主导地位。GZEL反应动力学参数表明GZEL的底物亲和力大小顺序为:甘油三酯>糖酯>磷脂。该酶在50°C有较好的稳定性,在60°C的半衰期为37.6 min,对中等碳链长度的甘油三酯（TC8）有较高偏好性。（2）基于单分子层技术进一步研究重组表达脂肪酶GZEL对不同磷脂底物的选择性。根据最大水解酶活的高低,脂肪酶GZEL对不同磷脂水解偏好的选择顺序为:PS>PG>PC>PI>CL>PA>PE,GZEL不能水解鞘磷脂（SM）;GZEL水解单半乳糖基甘油二酯（MGDG）的活力(6155.34 moles.cm‐2.min‐1.mg‐1)比水解磷脂的活力高,具有回收半乳糖脂上多不饱和脂肪酸的潜在应用价值;以甘油二酯类似物DDGs为底物研究GZEL对甘油三酯的位置选择性和立体选择性,结果表明GZEL属于sn-1,3位特异性脂肪酶,对间位1,3位甘油二酯有较高偏好性,对邻位1,2位甘油二酯选择性较低,并且不能水解sn-2位甘油酯;脂肪酶GZEL对R型底物有偏好性;将DiC8-PS和DiC8-MGDG与脂肪酶GZEL的开放结构进行分子对接,发现它们都能与GZEL催化口袋结合紧密,这与GZEL能表现磷脂酶活性和半乳糖脂酶活性相一致。将1,3-DDG（S2）和1,3-DDG（R2）与GZEL开放结构进行分子对接,发现R2可以更紧密地与GZEL的催化口袋结合并促进催化反应,为GZEL对R型底物偏好性提供结构基础。（3）C-端肽链对脂肪酶GZEL的底物选择性的影响研究。GZEL的C-端肽链由一个loop片段和一个α-螺旋片段组成。理性设计了脂肪酶GZEL的C-末端肽链缺失突变体,即GZEL-Δ（α-helix）和GZEL-Δ（α-helix+loop）,突变体在E.coli BL21 Star（DE3）plysS中成功表达,使用阴离子表面活性剂肌氨酸助溶,镍柱和DEAE离子交换层柱纯化,得到了纯度较高的可溶蛋白。对野生型和突变体的酶学性质比较发现,突变体的脂肪酶活性和磷脂酶活性均降低,且C-端肽链对脂肪酶GZEL的脂肪酶活性的影响大于磷脂酶活性,其中α-螺旋片段对GZEL的脂肪酶活性起着更重要的作用。突变体对阴离子型磷脂（PS,PG,CL,PI,PA）的水解活性显著降低,对两性离子磷脂（PC和PE）的水解活性影响很小。突变体对MGDG的水解活性均降低。（4）C-端肽链对脂肪酶GZEL的界面吸附性质的影响研究。通过定点突变,设计催化活性中心丝氨酸突变体,避免水解对吸附过程的影响。GZEL及其C-末端肽段缺失突变体在PE单分子层上的最大插入压力（MIP）值最大,蛋白对PE的结合能力最强。GZEL及其突变体的协同因子a>0,蛋白和底物存在正向相互作用。两个突变体的ΔΠ0均大于其平衡表面压力,即蛋白质易于从水下相迁移到界面并与磷脂结合。吸附常数ka、解吸附常数kd和吸附平衡常数KAds显示C-末端肽链的缺失使蛋白与磷脂结合发生显著变化。C-末端肽链的loop片段中富含的带电荷氨基酸（特别是精氨酸）和α-螺旋的两亲结构可能是形成有利于蛋白与底物单分子层结合并相互作用的结构基础,分子之间的静电相互作用也能促进蛋白与脂质膜的结合。尝试将C-端肽链的α-螺旋结构连接到米曲霉脂肪酶（MdlB）上,构建突变体MdlB-helix,MdlB-helix和MdlB的吸附动力学参数的研究结果进一步验证了C-末端肽链的α-螺旋结构对界面吸附的作用。