研究背景乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率分别位居女性恶性肿瘤第一位和第二位,严重威胁人类健康。在中国,乳腺癌的发病率和死亡率也呈现出逐年上升的趋势,2015年统计数据显示,乳腺癌发病人数约占所有新发肿瘤患者的15%。近年来,随着各国学者的不断努力,在乳腺癌的发病机制和个体化治疗方面均取得了重要进步。但是,乳腺癌的发生发展被认为是多基因多因素共同参与的多步骤演进过程,其高度的异质性导致患者预后及治疗反应存在较大差别。因此,寻找不同的生物标志物,阐明其在乳腺癌发生发展中的作用及临床意义,对于有效评估乳腺癌患者的预后状态和寻找潜在的治疗靶点具有非常重要的意义。与此同时,早期诊断并及时治疗可以极大的提高乳腺癌患者的预后生存。目前临床上乳腺癌的诊断主要依靠影像学方法(乳腺超声、铝靶摄影、核磁共振等),但因为敏感性不高或价格昂贵,使其应用受限。传统肿瘤标志物(CA-153、CEA)检测虽简单易行,但诊断敏感性和特异性不高,难以满足临床需求。因此,寻找敏感性、特异性高的循环生物标志物用于乳腺癌的无创诊断仍是目前关注的焦点。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸且没有蛋白编码功能的RNA分子,是人类转录组的主要组成部分。LncRNAs起初被认为是基因组的“转录噪音”,是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,不具备生物学功能。然而,近年来,越来越多的研究表明,lncRNAs可以作为癌基因或抑癌基因,通过与RNA、DNA及蛋白质等分子相互作用,在转录、转录后等多种水平调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化和迁移等生物学过程,进而在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。LncRNAs在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中表达异常,且在不同类型肿瘤中呈现出不同的表达模式;更为重要的是,研究表明lncRNAs可以较好的耐受温度、PH及核糖核酸酶,在血清/血浆中稳定存在,因此,探讨lncRNAs与肿瘤发生发展的相关性,将为开发肿瘤潜在诊断、预后标志物及治疗靶点提供重要依据。某些lncRNAs分子,如HOTAIR、H19等,已被报道能够参与乳腺癌的发生发展,然而,绝大多数lncRNAs在乳腺癌中的作用和临床意义尚有待确定。利用基因编辑工具进行lncRNAs研究,已逐渐成为各国学者研究的热点。其中,近年来备受关注的 CRISPR/Cas9(clustered.regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9)系统的基因编辑功能更加简便和高效,并在酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和人类细胞等多种生物中被广泛应用。CRISPR/Cas9系统利用向导RNA(guide RNA,gRNA)将Cas9核酸酶定位于目标基因DNA并进行切割,只需要应用不同的gRNA序列,即可同时编辑多个基因位点。利用CRISPR/Cas9技术构建细胞模型,将为肿瘤相关基因的研究提供便捷、可靠的手段,进而为探索肿瘤进展机制及治疗靶点提供技术支撑。然而,目前大部分关于CRISPR/Cas9基因编辑的研究都集中在蛋白编码基因上,关于其在非编码RNA研究中的应用较少,且效率不甚理想。因此,优化CRISPR/Cas9基因编辑系统,提高其稳定性和敲除效率,并将其应用于人体细胞lncRNAs的敲除,将有助于揭示lncRNAs在人类生理病理过程中的作用机理及临床意义。鉴于此,本研究依据课题组前期研究结果,利用在线数据库(cBioPortal)中TCGA数据集,分析LINC00310表达与乳腺癌进展的关系,并探讨其与乳腺癌患者预后的相关性,为乳腺癌患者的预后判断提供依据。采用dual gRNA CRISPR/Cas9基因敲除系统,构建LINC00310敲除(knock out,KO)乳腺癌细胞系,为后续的功能及机制研究提供可靠有效的手段。通过体外细胞实验和体内裸鼠成瘤实验,分析LINC00310参与乳腺癌进展的可能机制,为乳腺癌患者的临床生物学治疗提供潜在的有效靶点。进一步检测血清中LINC00310的表达,并分析其对乳腺癌患者的诊断价值,为乳腺癌的无创诊断开辟新的途径。综上所述,本研究从数据分析入手,建立了一种稳定、高效的dualgRNACRISPR/Cas9基因敲除系统,探讨了 LINC00310在乳腺癌中的作用及临床意义,这将为开展肿瘤相关lncRNAs研究提供新的思路和技术手段。第一部分乳腺癌中LINC00310的表达及预后价值研究目的:本研究旨在分析LINC00310在乳腺癌组织及细胞系中的表达水平,并探讨其与乳腺癌进展及患者预后的相关性。方法:1.利用在线数据库(cBioPortal)中TCGA数据集,分析LINC00310表达与乳腺癌进展、乳腺癌患者预后的相关性。2.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测乳腺癌组织、乳腺正常组织、人乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231和LM-4142)和人乳腺上皮细胞系(HMLE)中LINC00310的表达水平。结果:1.在线数据库(cBioPortal)TCGA数据集分析显示,与I期乳腺癌患者相比,进展期乳腺癌患者LINC00310表达显著升高(P<0.05)。LINC00310表达上调与乳腺癌患者的预后生存显著相关(P<0.05),尤其对于LINC00310高表达患者,其5年无病生存率显著低于LINC00310低表达患者(P<0.01)。2.组织芯片qRT-PCR结果表明,与正常乳腺组织比较,LINC00310在乳腺癌组织中的表达明显上调,二者相比较具有显著的统计学差异(P<0.05)。通过检测细胞系中LINC00310表达发现,与乳腺上皮细胞系HMLE相比,乳腺癌细胞系LM-4142中LINC00310表达显著上调(P<0.01)。结论:LINC00310表达与乳腺癌进展相关,并可以作为乳腺癌患者的预后标志物,提示其可能参与乳腺癌的发生发展,具有潜在的临床应用价值。第二部分利用CRISPR/Cas9技术构建LINC00310敲除乳腺癌细胞系目的:利用优化的dual gRNACRISPR/Cas9基因敲除系统,构建LINC00310 KO乳腺癌细胞系。方法:1.利用 CHOPCHOP 网站设计 LINC00310 dual gRNA,构建 LINC00310 dual gRNA 质粒及 LINC003 1 0 donor 质粒。2.选取LINC00310表达量较高的乳腺癌细胞系LM-4142,将含有Cas9的LINC00310 dual gRNA 质粒/dual gRNA 空载体(vector control)与 donor 质粒共转染,通过嘌呤霉素筛选后,将存活细胞用流式细胞术分选,以期获得LINC00310 KO单细胞克隆。3.应用基因组PCR(genomicPCR)对LINC00310KO细胞克隆进行筛选,并利用qRT-PCR检测LINC00310表达水平,最终鉴定获得LINC00310 KO LM-4142细胞系。结果:1.载体酶切鉴定和测序结果显示,成功构建LINC00310 dual gRNA质粒及LINC00310 donor 质粒。2.将 LINC00310 dual gRNA 质粒/vector control 及 donor 质粒共转染 LM-4142细胞,经嘌呤霉素筛选和流式细胞术分选后,成功获得LINC00310KO单细胞克隆。3.Genomic PCR及qRT-PCR鉴定结果显示KO#94为LINC00310完全敲除细胞系,KO#44、KO#117及KO#156为LINC00310部分敲除细胞系,选择KO#94和KO#44进行后续实验。结论:利用优化的dualgRNACRISPR/Cas9基因敲除系统,能够快速、有效的构建LINC00310 KO乳腺癌细胞系,为进一步研究LINC00310的功能及作用机制提供可靠手段。第三部分LINC00310在乳腺癌进展中的作用及机制研究目的:旨在通过体外细胞实验和体内裸鼠成瘤实验,探索LINC00310在乳腺癌进展中的功能,并探讨其作用靶点。方法:1.利用上述LINC00310KO#94和KO#44细胞克隆,通过MTT实验、克隆形成实验测定LINC00310对乳腺癌细胞增殖能力的影响。2.通过裸鼠成瘤实验检测LINC00310 KO对体内成瘤的影响。3.利用数据库(cBioPortal)TCGA数据及Spearman相关分析探索LINC00310的可能作用靶点。4.通过qRT-PCR及western blot实验检测细胞系及移植瘤中LINC00310及c-Myc的表达变化。5.构建LINC00310表达载体,感染KO细胞系,进行rescue实验,采用MTT实验、克隆形成实验验证LINC00310对乳腺癌细胞增殖能力的影响;通过qRT-PCR及western blot实验检测LINC00310及c-Myc的表达变化。结果:1.MTT实验和克隆形成实验表明,与vector control组相比,KO#94和KO#44组细胞增殖显著减弱(P<0.01)。2.利用数据库(cBioPortal)TCGA数据,采用Spearman相关分析,发现Myc蛋白表达与LINC00310表达呈显著相关(P=0.0081)。qRT-PCR及western blot结果显示,与vector control组相比,LINC00310 KO细胞系(KO#94和KO#44)中,c-MycmRNA及蛋白水平均明显降低(P<0.01)。3.裸鼠成瘤实验显示,与vetor control组比较,LINC00310 KO(KO#94)组移植瘤生长显著减慢(P<0.05),重量明显降低(P<0.05)。同时qRT-PCR和western blot实验结果证实LINC00310 KO显著抑制移植瘤c-Myc mRNA和蛋白表达(P<0.01)。4.利用LINC00310表达载体进行rescue实验,结果显示,LINC00310再表达能消除LINC00310 KO导致的细胞增殖抑制及c-Myc表达降低(P<0.01)。结论:LINC00310参与乳腺癌细胞的生长和增殖,并可能通过调节c-Myc表达促进乳腺癌发生发展,这不仅有助于阐明lncRNAs介导的乳腺癌进展机制,而且能够为寻找新的乳腺癌治疗靶点提供依据。第四部分血清LINC00310在乳腺癌中的诊断价值研究目的:本研究旨在检测乳腺癌血清中LINC00310的表达水平,并分析其稳定性及诊断价值,寻找敏感性、特异性高的乳腺癌诊断生物标志物。方法:1.采用qRT-PCR技术检测48例乳腺癌患者和47例健康对照者血清中LINC00310的表达水平,并评估室温存放时间、-80℃保存时间及反复冻融次数对血清中LINC00310表达稳定性的影响。2.利用受试者工作曲线(operating characteristic curve,ROC)评估血清LINC00310表达水平对乳腺癌的诊断效能。3.采用Mann-Whitney U检验统计分析血清LINC00310表达水平与乳腺癌患者临床病理参数之间的相关性。结果:1.血清样本qRT-PCR检测结果显示,与健康对照者比较,乳腺癌患者血清LINC00310表达水平显著升高(P<0.01)。将血清样本进行不同处理后(包括室温放置4小时、8小时或24小时;反复冻融2次、4次或8次;-80℃超低温冰箱放置1个月、2个月或3个月),LINC00310的表达水平无明显变化(P>0.05)。2.ROC曲线评估血清LINC00310诊断乳腺癌的曲线下面积(Area under ROC curve,AUC)为0.828,诊断敏感性为77.08%,特异性为87.23%。3.血清LINC00310表达与乳腺癌患者临床病理参数的相关性分析结果显示,血清LINC00310表达水平与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分级、淋巴结转移状态、雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor2,HER-2)状态均无显著相关性(P>0.05)。结论:血清LINC00310可以作为潜在肿瘤标志物用于乳腺癌的诊断,为乳腺癌的无创性诊断提供了一条的新的途径。