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背景与目的:
肝癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内50％的肝癌患者发生在我国。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中最常见的病理组织学类型，其复发和转移率都很高，死亡率在世界范围内占恶性肿瘤死亡率的第3位。同其它恶性肿瘤一样，肝癌的发生发展涉及多种基因表达和结构的异常。然而，肝细胞癌的分子病理机制较为复杂，目前仍不十分明确。近年来，发现了一种新的调控RNAs——microRNAs(miRNAs)。研究证实miRNAs的异常表达参与肝细胞癌的分子病理进程。
MiRNAs是一种全长仅有18～24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，通过与信使RNAs（mRNAs）的3非编码区(3UTR)结合负向调节基因的表达。近来的研究表明多种miRNAs在各种病理进程中发挥重要作用，如肿瘤的增殖、分化和凋亡。在肝癌中也发现了多种异常表达的miRNAs，且异常表达的miRNAs通过调控靶标mRNAs参与肝细胞癌的分子病理进程。根据靶标基因生物学功能的不同，miRNA充当着肿瘤抑制基因或癌基因的角色。研究指出miR-22、miR-29c、miR-101、miR-122a、miR-124、miR-125b、miR-142-3p、miR-199a-3p、miR-519d和miR-637等在肝细胞癌中表达降低，且参与肝细胞癌的发生发展。相反，其它的miRNAs，如miR-29a和miR-191在肝细胞癌中表达增高。检测肿瘤相关的特异miRNAs以及靶标基因，能够进一步明确肿瘤的发生机制，也许对新的治疗策略的探索也有重要意义。最近的研究指出miR-219在鳞状细胞癌和成神经管细胞瘤中表达降低。Izzotti等研究发现在肺组织的癌前病变中miR-219表达降低。基因芯片分析显示在乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒相关的疾病中，如慢性肝炎和肝细胞癌，miR-219的表达较正常组织显著降低。然而，miR-219在肝细胞癌中的作用仍不甚明确。在这个的研究中，我们将关注miR-219在肝细胞癌中的表达和功能。
方法:
一.MiR-219-5p在肝细胞癌中的表达及其临床意义
1.肝细胞癌患者癌组织、癌旁组织及临床病理参数的收集
收集2001年～2008年南方医院手术切除的肝细胞癌组织标本及癌旁组织标本83例，肿瘤组织经病理检查诊断均为原发性肝细胞癌。相对应的癌旁组织距离肿瘤边缘5cm。所有的组织标本用10％福尔马林固定，石蜡包埋。患者在手术前未接受过局部或系统治疗。根据WHO的标准对组织分化进行分级，根据UICC/AJCC2002版进行TNM分期。
2.组织中miR-219-5p的检测
应用TRIzol法提取组织中的总RNA，通过荧光定量PCR法检测miR-219-5p的表达:茎环法进行RNA逆转录，SYBR(R)Green染料扩增cDNA。
3.癌组织miR-219-5p表达的判定
PCR实验重复3次，取平均Ct值，以snRNAU6作为内参，计算2-△△Ct值。MiR-219-5p在癌组织中的表达情况以癌旁组织作为对照。数据经log2转换，当＜-1.0时定义为表达下降;当＞-1.0时定义为表达正常/增加。
二.上调miR-219-5p表达对肝细胞癌细胞株增殖的影响
1.细胞株的培养条件
人肝细胞癌细胞株Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2、HCCLM6，以及人肝细胞株HL-7702使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，至37℃、5％CO2、相对湿度95％的培养箱内培养。
2.细胞株中miR-219-5p的检测
应用TRIzol法提取细胞株中的总RNA，通过荧光定量PCR法检测miR-219-5p的表达:茎环法进行RNA逆转录，SYBR(R)Green染料扩增cDNA。
3.MiR-219-5pmimics转染Huh-7和HepG2细胞
采用Lipofectamine2000法转染细胞株，mimics转染的终浓度为50nM，转染后荧光显微镜下观察细胞转染效率，并通过荧光定量PCR法检测转染后细胞miR-219-5p的表达情况。
4.上调miR-219-5p表达对Huh-7和HepG2细胞增殖的影响
转染miR-219-5pmimics后，通过CCK-8法、克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验、细胞周期及细胞凋亡实验，观察细胞增殖能力、细胞周期和凋亡的变化。
三.下调miR-219-5p表达对MHCC-97L细胞增殖的影响
1.MiR-219-5pinhibitors转染MHCC-97L细胞
采用Lipofectamine2000法转染细胞株，inhibitors的终浓度为100nM，通过荧光定量PCR法检测转染后细胞miR-219-5p的表达情况。
2.下调miR-219-5p表达对MHCC-97L细胞体外增殖的影响
转染miR-219-5pinhibitors后，通过CCK-8法、克隆形成实验及细胞周期实验，观察细胞增殖能力和细胞周期的变化。
四.肝细胞癌中miR-219-5p对GPC3表达的调控
1.构建野生型GPC33UTR(wGPC33UTR)和突变型GPC33UTR(mGPC33UTR)质粒。
2.双荧光素酶活性检测:miR-219-5pmimics/m-NCs与质粒共转染HEK-293T细胞，48小时后检测双荧光素酶活性变化差异。
3.通过荧光定量PCR法及琼脂糖凝胶电泳检测HepG2和Huh-7细胞转染mimics后GPC3mRNA的表达的变化。
4.通过westernblot法检测HepG2细胞转染mimics后，GPC3蛋白表达的变化。
5.在前面83例中选取明确GPC3蛋白表达的45例肝细胞癌患者，统计分析miR-219-5p表达与GPC3蛋白表达的吻合情况。
结果:
一.MiR-219-5p在肝细胞癌中的表达及其临床意义
1.癌组织miR-219-5p平均2-△△Ct值为0.16±0.17，癌旁组织miR-219-5p平均2-△△Ct值为0.41±0.23，差值有统计学意义(P＜0.001)，癌组织中miR-219-5p的表达水平显著降低。
2.通过log2转换，83例肝细胞癌患者中，51例(61.45％)miR-219-5p表达降低。
3.单因素分析显示:①肿瘤最大径≥5cm的肝细胞癌患者miR-219-5p表达显著低于肿瘤最大径＜5cm的患者(P＜0.05);②组织分化差的肝细胞患者miR-219-5p表达显著低于组织分化较好的患者(P＜0.05);③在不同性别、年龄、血清HBsAg、血清AFP、肝硬化情况、TNM分期中，miR-219-5p表达水平无显著性差异(P＞0.05)。
4.逐步Logistic回归分析结果显示:对miR-219-5p表达有显著影响的临床病理参数是组织分化程度(P＜0.05)，组织分化差的患者miR-219-5p表达降低的危险性是分化好的患者的4.419倍。
5.Kaplan-Meier法和Log-ranktest分析显示:miR-219-5p高表达的肝细胞患者中位生存时间为30.0个月(95％CI:18.934～41.066)，miR-219-5p低表达的肝细胞癌患者中位生存时间为13.0个月(95％CI:9.895～16.105)，miR-219-5p表达减少患者预后差(P=0.005，Log-ranktest)。
6.肝细胞癌患者生存时间影响的多因素分析显示:变量miR-219-5p水平、血清AFP、肿瘤大小、有无肝硬化及TNM分期是肝细胞癌患者生存的影响因素(P＜0.05)。5个变量的HR值均大于1，表明:miR-219-5p表达水平低的患者死亡风险较表达水平高的患者大;血清AFP阳性、肿瘤最大径≥5cm、存在肝硬化、TNM分期晚的患者，死亡风险更大。
二.上调miR-219-5p表达对肝细胞癌细胞株增殖的影响
1.与正常肝细胞HL-7702相比，miR-219-5p在Huh-7、HepG2和HCCLM6中表达显著降低(P＜0.05)。而MHCCL-97H和MHCCL97L细胞miR-219-5p的表达与HL-7702细胞相比无统计学差异(P＞0.05)。
2.荧光显微镜下可见Huh-7和HepG2细胞转染效果理想，荧光定量PCR检测Huh-7和HepG2细胞mimics转染后miR-219-5p的表达，结果示mimics转染组细胞miR-219-5p表达较空白组和对照组显著升高(P＜0.05)。
3.CCK-8法检测Huh-7和HepG2细胞转染mimics后体外增殖能力的变化，结果示:48h和72h时，mimics转染组细胞增殖能力显著低于对照组细胞(P＜0.05);两株细胞不同处理组与培养时间存在显著的交互效应(P＜0.001)，两株细胞不同处理组间细胞增殖能力的差异随时间发生变化，在72h时更为显著。
4.细胞克隆形成实验研究显示mimics组HepG2细胞克隆形成率较m-NCs组显著降低(P＜0.001)。
5.裸鼠皮下成瘤实验显示，mimics转染后皮下肿瘤的重量较对照组显著减轻(P=0.025);两组间肿瘤体积有显著性差异(P=0.001)，两组间体积大小的差异随着饲养天数的增加而增大(P=0.002)。
6.细胞周期检测的结果显示:与对照组细胞相比，mimics组HepG2细胞G1期比例显著增加(P=0.009)，S期比例显著减低(P=0.018)。
7.细胞凋亡检测结果显示:两组间细胞凋亡在48h和72h时均无统计学差异(P=0.288);不同培养时间之间的细胞凋亡率有显著性差异(P＜0.001);不同培养时间之间细胞凋亡率的差异与处理因素无关(P=0.585)。
三.下调miR-219-5p表达对MHCC-97L细胞增殖的影响
1.荧光定量PCR检测MHCC-97L细胞inhibitors转染后miR-219-5p的表达，结果示inhibitors转染组细胞miR-219-5p表达较空白组和对照组显著降低(P＜0.05)。
2.CCK-8法检测MCHH-97L细胞转染inhibitors后体外增殖能力的变化，结果示:72h和96h时，inhibitors转染组细胞增殖水平显著高于对照组细胞(P＜0.05);两处理组细胞增殖水平随着培养时间的增加而显著增高(P＜0.001);两处理组间增殖水平的差异随着培养时间的增加而增大(P=0.002)。
3.通过平板克隆形成实验分析下调miR-219-5p对MHCC-97L细胞增殖的影响，结果显示:inhibitors组MHCC-97L细胞克隆形成率较i-NCs组高，差异有统计学意义(P=0.001)。
4.细胞周期检测的结果显示:与对照组细胞相比，inhibitors组MHCC-97L细胞G1期比例显著减少(P=0.002)，S期比例显著增加(P＜0.001)。
四.肝细胞癌中miR-219-5p对GPC3表达的调控
1.成功构建野生型GPC33UTR（wGPC33UTR）和突变型GPC33UTR(mGPC33UTR)质粒，并通过测序鉴定。
2.MiR-219-5pmimics/m-NCs与载体共转染HEK-293T细胞，48h检测双荧光素酶活性，结果显示:空载psi-CHECH2质粒的实验中，miR-219-5pmimics组与m-NCs组活性倍数无显著差异(P=0.098);wGPC33UTR的实验中，miR-219-5pmimics组与m-NCs组相比，活性倍数显著下降(P=0.004);mGPC33UTR的实验中，miR-219-5pmimics组与m-NCs组活性倍数无显著差异(P=0.515)，表明miR-219-5p可与wGPC33UTR结合。
3.转染mimics后，通过荧光定量PCR法检测HepG2和Huh-7细胞GPC3mRNA的表达水平，结果提示转染48小时后，HepG2和Huh-7细胞GPC3mRNA的表达均显著下降(P＜0.01)。
4.Westernblot检测提示转染96h后HepG2细胞GPC3蛋白表达明显下降。
5.分析45例肝细胞癌患者中miR-219-5p表达与GPC3表达的关系，结果表明:McNemar检验示miR-219-5p表达正常/上调与GPC3表达“-/+”的情况无显著差异(P=0.302);κ检验示miR-219-5p表达正常/上调与GPC3表达“-/+”的吻合度有统计学意义，但吻合度较弱(κ=0.308，P＜0.05)。
结论:
1.MiR-219-5p在肝细胞癌癌组织中表达下降;其表达水平与患者肿瘤组织分化程度有关，组织分化程度低是miR-219-5p表达降低的因素;miR-219-5p低表达的肝细胞癌患者生存时间短于miR-219-5p高表达的患者;miR-219-5p水平与血清AFP、肿瘤大小、有无肝硬化、TNM分期是肝细胞癌患者生存的影响因素。
2.MiR-219-5p在体内外能抑制肝细胞癌细胞增殖，并介导G1期细胞阻滞，但对细胞凋亡无影响。
3.MiR-219-5p能与GPC33UTR结合，并抑制GPC3mRNA和蛋白的表达。
4.肝细胞癌患者癌组织miR-219-5p表达下调与GPC3表达增高的情况有一定程度的吻合，但这两者间的一致性较差。