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已有研究发现NO及iNOS在多种恶性肿瘤中呈高表达,如乳腺癌,胃癌,卵巢癌,黑色素瘤,宫颈癌等。NO和iNOS的表达程度与肿瘤的分化,转移,浸润能力成正相关。国内外有较多的研究发现抑制iNOS合成NO,可以在多个方面抑制肿瘤的发展。目前有较多的NOS抑制剂被研制开发出来,并且他们的作用已经得到肯定。1400W是具有高选择性的iNOS抑制剂之一。对iNOS的选择性较eNOS高出5000倍,较nNOS高出200倍。研究发现1400W主要通过与精氨酸特异性竞争iNOS精氨酸结合位点而发挥作用。但是迄今为止,对于NO,iNOS及其抑制剂对宫颈癌的作用研究较少,因此本课题利用宫颈癌宫颈癌Hela细胞株,研究iNOS在宫颈癌细胞株中的表达情况,观察iNOS抑制剂单独和联合顺铂对Hela细胞的作用,希望为宫颈癌的综合治疗提供理论基础。
一.宫颈癌Hela细胞中iNOS的表达
目的:了解iNOS在宫颈癌Hela细胞中表达情况。
方法:宫颈癌Hela细胞株复苏后培养,采用免疫组化法检测宫颈癌Hela细胞中iNOS的表达情况,应用 western blot方法检测细胞中iNOS蛋白表达情况。
结果:免疫组化法发现iNOS在宫颈癌Hela细胞中呈阳性表达,主要位于细胞浆内,部分位于细胞胞膜上。Western blot结果也提示宫颈癌Hela细胞中iNOS蛋白表达阳性,分子量为130kb。
二.iNOS抑制剂1400W及顺铂对宫颈癌Hela细胞增殖的影响
目的:了解1400W,顺铂对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。
方法:应用MTT检测1400W和顺铂对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用,其中顺铂浓度取0.5mg/ml,1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml,8mg/ml,1400W浓度取20umol/L,40umol/L,分别观察24hr,48hr,72hr。
结果:1400W和顺铂均能抑制宫颈癌Hela细胞生长,其抑制作用与剂量相关,但未呈现时效关系。
三.iNOS抑制剂1400W及顺铂对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响
目的:了解1400W及顺铂对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响。
方法:培养宫颈癌Hela细胞,分为对照组(培液),顺铂组(顺铂4ug/ml),1400W组(1400W40umol/L)和顺铂+1400W(顺铂4ug/ml+1400W 40umol/L),采用流式细胞仪检测宫颈癌Hela细胞经作用24hr,48hr和72hr后凋亡情况。
结果:对照组,顺铂组,1400W组,顺铂+1400W组中,24hr后宫颈癌Hela细胞的凋亡率分别为(2.53±0.81)%,(9.00±0.40)%,(1.94±0.21)%和(15.75±1.69)%;48hr后宫颈癌Hela细胞的凋亡率分别为(5.65±0.00)%,(11.12±1.38)%,(4.09±0.52)%和(45.70±2.11)%;72hr后宫颈癌Hela细胞的凋亡率分别为(4.42±0.04)%,(25.30±0.22)%,(4.92±0.87)%和(60.34±0.98)%。其中顺铂组与对照组比较p<0.05,1400W组与对照组比较p>0.05,1400W联合顺铂组与对照组比较P值<0.05,与顺铂组比较P值<0.05。
四.iNOS抑制剂1400W及顺铂对宫颈癌Hela细胞iNOSmRNA表达的影响
目的:了解1400W及顺铂对宫颈癌Hela细胞iNOSmRNA表达的影响。
方法:培养瓶培养细胞,分为对照组(培液),顺铂组(顺铂4ug/ml),1400W组(1400W40umol/L)和顺铂+1400W(顺铂4ug/ml+1400W 40umol/L),采用RT-PCR检测宫颈癌Hela细胞经作用24hr,48hr和72hr后iNOSmRNA表达情况。
结果:在对照组,顺铂组,1400W组,和顺铂+1400W组,作用24hr后宫颈癌Hela细胞iNOSmRNA表达量分别为0.72±0.15,0.58±0.04,0.65±0.20和0.34±0.12;作用48hr后宫颈癌Hela细胞iNOSmRNA表达量分别为0.98±0.25,0.47±0.02,0.70+0.36和0.31±0.08;作用72hr后宫颈癌Hela细胞iNOSmRNA表达量分别为0.72±0.05,0.40±0.06,0.62±0.12和0.17±0.05。其中顺铂与对照组比较p<0.05,1400W与对照组比较p>0.05,1400W联合顺铂与对照组比较P值<0。05,与顺铂组比较P值<0.05。
结论:本实验结果提示,iNOS在宫颈癌Hela细胞中呈阳性表达,1400W及顺铂均可抑制宫颈癌Hela细胞增殖。1400W联合顺铂可以明显增加宫颈癌Hela细胞凋亡率,抑制宫颈癌Hela细胞iNOSmRNA表达,并且较单独使用顺铂时作用更显著,而单用1400W时宫颈癌Hela细胞凋亡率及iNOSmRNA表达情况均没有显著差异,说明两者之间存在协同作用。联合iNOS抑制剂可以增强顺铂抗肿瘤的作用,这是一种很有希望的新辅助疗法,为宫颈癌的治疗提供了新的思路。