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目的:构建Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株临床分离株(以下简称H37Rv菌株)、Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株临床分离株(以下简称H37Ra菌株)和Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株(以下简称XJ菌株)。比较分析和探讨研究Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株致病性的影响。方法:提取本课题组前期构建的结核杆菌-大肠杆菌重组穿梭质粒PMV361Pup,PMV361Mpa,PMV361Dop和PMV361paf A,进一步利用电转化方法分别将重组穿梭质粒PMV361Pup,PMV361Mpa,PMV361Dop和PMV361paf A转入H37Rv菌株临床分离株、H37Ra菌株临床分离株和新疆优势强毒菌株临床分离株的感受态细胞,分别构建Pup基因过表达的H37Rv菌株临床分离株(以下简称H37Rv::Pup菌株),Mpa基因过表达的H37Rv菌株临床分离株(以下简称H37Rv::Mpa菌株),Dop基因过表达的H37Rv菌株临床分离株(以下简称H37Rv::Dop菌株),paf A基因过表达的H37Rv菌株临床分离株(以下简称H37Rv::paf A菌株),Pup基因过表达的H37Ra菌株临床分离株(以下简称H37Ra::Pup菌株),Mpa基因过表达的H37Ra菌株临床分离株(以下简称H37Ra::Mpa菌株),Dop基因过表达的H37Ra菌株临床分离株(以下简称H37Ra::Dop菌株),paf A基因过表达的H37Ra菌株临床分离株(以下简称H37Ra::paf A菌株),Pup基因过表达的新疆优势强毒菌株临床分离株(以下简称XJ::Pup菌株),Mpa基因过表达的新疆优势强毒菌株临床分离株(以下简称XJ::Mpa菌株),Dop基因过表达的新疆优势强毒菌株临床分离株(以下简称XJ::Dop菌株),paf A基因过表达的新疆优势强毒菌株临床分离株(以下简称XJ::paf A菌株),应用QRT-PCR技术检测及鉴定已构建的各Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的H37Rv菌株组、Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的H37Ra菌株组和Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的新疆优势强毒菌株组的各Pup/Mpa/Dop/paf A基因的m RNA表达水平;分别用构建的Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达的H37Ra菌株、H37Rv菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株组感染小鼠腹腔巨噬细胞,同时设定H37Ra菌株、H37Rv菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株组感染小鼠腹腔巨噬细胞作为对照组,于感染模型复制成功后1h、6 h、12 h及24 h,利用流式细胞技术检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化。分别用各Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达H37Rv菌株组,Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达H37Ra菌株组和Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株组分别感染小鼠腹腔巨噬细胞后24h、96h,同时设未过表达的H37Rv菌株、H37Ra菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株组作为对照;分别对各组细胞的裂解物进行细菌培养,菌落计数,观察各组细菌在小鼠腹腔巨噬细胞内的增殖能力。结果:1.应用电穿孔技术分别将各重组穿梭质粒导入不同毒力菌株,经药物筛选、应用QRT-PCR技术检测及鉴定已构建的各过表达菌株,确定各过表达菌株中各基因的过表达水平,确保目的基因在各菌株上均有不同程度的表达;2.Annexin V-FITC/PI双染法检测各结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡结果显示:H37Ra::Pup;H37Ra::Mpa;H37Ra::Dop;H37Ra::paf A菌株分别感染巨噬细胞组,各菌株感染巨噬细胞的凋亡率在1h、6h、12h和24h呈上升趋势;上述各菌株感染巨噬细胞组分别与H37Ra菌株感染巨噬细胞组相比较,各菌株感染巨噬细胞的凋亡率,在同一时间点其凋亡率均降低。H37Rv::Pup;H37Rv::Mpa;H37Rv::Dop;H37Rv::paf A菌株分别感染巨噬细胞组,各菌株感染巨噬细胞的凋亡率在1h、6h、12h和24h呈上升趋势;上述各菌株感染巨噬细胞组分别与H37Rv菌株感染巨噬细胞组比较,各菌株感染巨噬细胞的凋亡率,在同一时间点其凋亡率均降低。XJ::Pup;XJ::Mpa;XJ::Dop;XJ::paf A菌株分别感染巨噬细胞组,各菌株感染巨噬细胞的凋亡率在1h、6h、12h和24h呈上升趋势,;上述各菌株感染巨噬细胞组分别与优势株菌株对照组感染巨噬细胞组比较,各菌株感染巨噬细胞的凋亡率,在同一时间点其凋亡率均降低。与H37Ra::Pup;H37Ra::Mpa;H37Ra::Dop;H37Ra::paf A菌株分别感染巨噬细胞组相比较,H37Rv::Pup;H37Rv::Mpa;H37Rv::Dop;H37Rv::paf A菌株分别感染巨噬细胞组后各菌株感染巨噬细胞的凋亡率,在同一时间点其凋亡率均降低;XJ::Pup;XJ::Mpa;XJ::Dop;XJ::paf A菌株分别感染巨噬细胞组其各菌株感染巨噬细胞的凋亡率,在同一时间点其凋亡率均降低。3.各过表达菌株组分别感染小鼠腹腔巨噬细胞,同时设未过表达的H37Rv菌株、H37Ra菌株和新疆优势强毒结核分枝杆菌菌株组作为对照;CFU菌落计数检测结果显示:各Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达结核分枝杆菌H37Ra菌株、Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达结核分枝杆菌H37Rv菌株和Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株组分别感染RAW264.7细胞,上述各菌株组感染RAW264.7细胞后96h实验组和对照组细胞裂解物细菌培养菌落计数,结果显示:上述Pup/Mpa/Dop/paf A过表达的各结核分枝杆菌菌株组的细胞裂解物的菌落计数均显著高于Pup/Mpa/Dop/paf A未过表达的对照组,其在巨噬细胞内的增殖能力明显增强。结论:1.成功构建Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达结核分枝杆菌H37Ra菌株、Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达结核分枝杆菌H37Rv菌株和Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株;2.不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞,诱导巨噬细胞凋亡水平不同可能与它们诱导产生的Pup、Mpa、Dop、paf A基因的表达水平不同有关;3.Pup/Mpa/Dop/paf A基因过表达可以增强H37Ra菌株、H37Rv菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌菌株的毒性及其致病性。