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增生性瘢痕是皮肤损伤后创面愈合的异常结果，在国人中的发病率很高[1]，增生性瘢痕的预防和治疗也是整形外科的重点研究领域之一，其常发生于各种烧、创伤和手术之后，由于其形成机制并不十分清楚，目前依然缺乏有效的防治方法[2]。近年来的研究表明血管化与增生性瘢痕的形成密切相关[3]，血管化过程中有多种细胞因子的共同参与，其中血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知的作用最强的促血管生成因子之一[4]，VEGF的高表达与增生性瘢痕的形成密切相关。本实验室在此理论的基础上，已经设计、合成、筛选出了针对VEGF抑制效果最佳的小干扰RNA片段，并构建了该干涉片段的慢病毒载体——慢病毒介导的靶向沉默血管内皮生长因子（Lentivirus-mediated silence interferenceVEGF，LV-SiVEGF）[5]。实验一拟在本实验室前期研究的基础上，将LV-SiVEGF基因作用于兔耳增生性瘢痕动物模型，通过对兔耳组织中增生性瘢痕指数、成纤维细胞增殖、胶原合成、血管内皮细胞的检测，超微结构变化等，探讨通过血管靶向基因治疗抑制增生性瘢痕的可行性。同时，我们前期的研究还发现重组血管生成抑制剂（Proteins containingMetalloprotease and Thrombospondin domain-1，METH-1）对增生性瘢痕也有明显的抑制作用[6]，并构建出了METH-1的慢病毒载体——慢病毒介导的重组血管生成抑制剂METH-1（Lentivirus-mediated METH-1，LV-METH-1）[7]。因此，实验二拟在兔耳增生性瘢痕动物模型上，观察稳定干扰VEGF的表达和联合应用重组血管生成抑制剂METH-1对兔耳增生性瘢痕形成的影响，通过对增生性瘢痕指数、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞的检测等，深入研究血管靶向基因治疗抑制增生性瘢痕形成的可行性，进一步探寻对增生性瘢痕行之有效的防治方法。全文包括两个部分：第一部分：靶向沉默VEGF对兔耳增生性瘢痕的影响目的探讨慢病毒介导的靶向沉默血管内皮生长因子LV-SiVEGF对兔耳增生性瘢痕形成的影响及其可能的作用机制，研究血管靶向基因治疗对兔耳增生性瘢痕的预防作用。方法以10只日本大耳白兔建立兔耳增生性瘢痕模型，并随机选择兔的左、右耳作为实验组和对照组。待创面愈合后，实验组注射携带有干扰序列LV-SiVEGF的重组慢病毒，对应的作为对照组注射慢病毒介导的空载病毒对照（Lentivirus-mediated No-load virus control，LV-NC）。创面愈合后第30天取材，观察对比各组瘢痕外观形态的变化，并对瘢痕组织进行HE染色、Masson染色、CD34染色、VEGF染色、透射电镜观察，研究分析靶向沉默兔耳瘢痕组织中VEGF的表达对组织内增生性瘢痕指数、组织血管生成、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞增殖的影响。结果与对照组相比，实验组血管靶向基因治疗30天后，兔耳增生性瘢痕中微血管生成明显减少、胶原合成及成纤维细胞增殖均受到明显抑制，超微结构观察结果显示血管内皮细胞活性下降。结论瘢痕形成早期应用LV-SiVEGF基因治疗可明显抑制兔耳增生性瘢痕的形成。第二部分：靶向沉默VEGF与重组血管生成抑制剂METH-1单独和联合应用对兔耳增生性瘢痕的影响目的探讨慢病毒介导的靶向沉默血管内皮生长因子LV-SiVEGF与慢病毒介导的重组血管生成抑制剂LV-METH-1单独和联合应用对兔耳增生性瘢痕形成的影响及其可能的作用机制，研究血管靶向基因治疗对兔耳增生性瘢痕的预防作用。方法选择20只日本大耳白兔复制出兔耳增生性瘢痕模型，并随机将创面分为四个实验组：对照组、单独LV-SiVEGF组、单独LV-METH-1组、联合应用组。待创面愈合后，对照组注射无关的LV-NC空载慢病毒；单独LV-SiVEGF组注射携带有干扰序列LV-SiVEGF的重组慢病毒；单独LV-METH-1组注射携带有目的基因LV-METH-1的重组慢病毒；联合应用组注射携带有干扰序列LV-SiVEGF和目的基因LV-METH-1的重组慢病毒。创面愈合后第30天取材，观察对比各组瘢痕外观形态的变化，并对瘢痕组织进行HE染色、Masson染色、CD34染色、VEGF染色、透射电镜观察，研究分析靶向沉默兔耳瘢痕组织中VEGF的表达对组织内增生性瘢痕指数、组织血管生成、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞增殖的影响。结果与对照组相比，单独LV-SiVEGF组、单独LV-METH-1组、联合应用组血管靶向基因治疗30天后，兔耳增生性瘢痕中微血管生成均有不同程度的减少（血管数目计数：对照组>单独LV-METH-1组>单独LV-SiVEGF组>联合应用组）、胶原合成及成纤维细胞增殖均受到不同程度的抑制（成纤维细胞计数：对照组>单独LV-METH-1组>单独LV-SiVEGF组>联合应用组）。结论瘢痕形成早期应用LV-SiVEGF或/和LV-METH-1进行基因治疗可明显抑制兔耳增生性瘢痕的形成，其中，应用抑制效果由好到差依次是联合应用组、单独LV-SiVEGF组、单独LV-METH-1组。本课题主要是观察和验证两种基因LV-SiVEGF和LV-METH-1在动物体内对增生性瘢痕的影响，动物模型采用本实验室应用比较成熟的兔耳增生性瘢痕动物模型，将LV-SiVEGF和LV-METH-1基因作用于兔耳局部，通过对增生性瘢痕指数、组织血管生成、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞的检测等，探讨通过血管靶向基因治疗抑制增生性瘢痕这条路径的可行性。