论文部分内容阅读
土壤盐碱化、干旱和低温等逆境胁迫已经成为制约农作物生长发育的主要因素，并且对农业的发展及粮食的保障产生了很不利的影响。大豆是主要的经济作物，逆境胁迫严重影响大豆的长势，因而，提高大豆对逆境胁迫的耐受力，是提高大豆产量和品质、保障粮食安全的根本途径。CBL基因家族是主要的钙离子感受器，在植物生长发育和响应逆境胁迫方面发挥重要的作用。目前关于大豆CBL基因家族的研究甚少，因此，深入挖掘大豆CBL基因家族中响应逆境胁迫的功能基因，对解析大豆响应逆境胁迫的分子机制及大豆抗逆新品种的遗传改良具有重要意义。 本研究以大豆品种“黑农52”为材料，运用实时荧光定量PCR技术分析了高盐、低钾、干旱、低温胁迫和ABA激素诱导条件下大豆CBL基因家族的表达模式及在正常生长条件下不同组织的表达模式;并分析了该基因家族的生物信息学特征;通过同源克隆技术，从大豆中克隆了与拟南芥AtCBL4、AtCBL6基因同源的GmCBL4和GmCBL6基因，并构建了GmCBL4基因的植物过表达载体，为GmCBL4基因的功能研究奠定基础;同时构建了GmCBL4基因与GFP基因的融合表达载体，通过亚细胞定位技术分析了GmCBL4基因在细胞内的定位情况。获得的研究结果如下: 1.GmCBL基因家族在逆境胁迫和激素诱导下的表达模式分析 组织特异性表达模式分析表明，GmCBL1、GmCBL2、GmCBL4、GmCBL8相对表达量在根中最高，GmCBL6在成熟叶片中最高，GmCBL10在茎中最高。逆境胁迫及激素诱导下的表达模式分析表明，大豆CBL基因家族对逆境胁迫的响应均呈现出不同的表达模式，GmCBL1、GmCBL6在高盐、干旱、低温的诱导下表达;GmCBL2主要响应低温胁迫的诱导;GmCBL4响应高盐、低钾、干旱和ABA的诱导;GmCBL8主要响应高盐的诱导;GmCBL10对多种胁迫和ABA的诱导表达变化不明显。 2.GmCBL基因家族的生物信息学分析 通过拟南芥CBLs基因序列在大豆数据库进行比对获得6个大豆CBL基因家族成员，其蛋白序列长度在213～263个氨基酸之间，等电点范围均在5.20左右。染色体定位分析显示，GmCBL8、GmCBL1、GmCBL4、GmCBL10、GmCBL2、GmCBL6分别位于大豆4、5、6、7、8、17号染色体上。GmCBL基因家族氨基酸序列多重比对及保守结构域预测表明，该家族成员均含有3个典型的EF-hand保守结构域，并且在GmCBL1、GmCBL4、GmCBL8中具有膜定位功能的N-豆蔻酰化结构域(MGCXXSK/T)。GmCBLs基因外显子—内含子结构分析表明，该基因家族每个成员均分别含有8-9个外显子和内含子。GmCBLs与拟南芥、水稻、玉米和高粱中CBL家族的系统进化分析表明，GmCBLs与拟南芥CBLs的亲缘关系最近。 3.GmCBL4、GmCBL6基因的克隆与序列分析 通过PCR从大豆中扩增得到了GmCBL4、GmCBL6基因，其CDS序列长度分别为672bp和681bp，分别编码223个氨基酸和226个氨基酸，均具有典型的EF hand结构域。Neighbor-joining进化树分析结果显示，GmCBL4、GmCBL6蛋白分别与野生大豆（Glycine soja）、红豆（Vigna angularis）中同源蛋白的亲缘关系最近。 4.GmCBL4基因植物表达载体构建与亚细胞定位分析 构建了植物过表达载体pBI121-GmCBL4和亚细胞定位表达载体pCAMBIA1302-GFP-GmCBL4，亚细胞定位分析结果显示，GmCBL4定位于细胞膜。