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鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)是冠状病毒科Gamma冠状病毒属的成员,其引起的鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是鸡的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。IBV基因组容易变异,导致病毒血清型和致病性多样化,各血清型之间交叉保护作用有限,给养禽业带来很大的经济损失。因此,做好该病的防控具有极其重要的意义。IBV感染致病与免疫机制是IB防控研究的主要方向之一。天然(固有)免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线,在宿主防御IBV中起重要作用。研究表明冠状病毒调控天然免疫反应具有多样性和复杂性,导致冠状病毒致病性和免疫性的差异,不同IBV毒株对不同组织的致病性可能与病毒引起的固有免疫反应有关。因此,深入研究不同致病性IBV感染宿主后不同靶组织的天然免疫反应具有重要意义。IBV有多种临床致病型,其中呼吸型和肾型为两种主要的致病型。本课题应用不同血清型的呼吸型和肾型IBV毒株分别感染SPF鸡,并对感染鸡气管和肾脏TLR3和TLR7信号通路进行研究,同时研究此两种IBV感染对核转录因子IRF7和NF-κB p65表达的影响,并在此基础上,通过过表达或敲低表达研究Viperin和IFIT5对IBV复制的影响。一、IBV感染对鸡气管和肾脏TLR3和TLR7信号通路的影响本研究应用不同血清型IBV的呼吸型M41株和肾型GX-YL5株分别感染SPF鸡,观察感染后气管黏膜和肾脏组织病理变化,同时检测病毒载量、TLR3和TLR7信号通路关键分子、炎症相关细胞因子、Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因(ISG)的mRNA以及TLR3和细胞因子蛋白表达的变化。结果显示,M41和GX-YL5株感染气管黏膜均在1-11 dpi出现病变,病毒载量迅速上升,M41株感染肾脏病变轻微,病毒载量较低,而GX-YL5株感染肾脏出现严重肾炎和很高的病毒载量;TLR3和TLR7信号通路关键分子的mRNA在M41和GX-YL5株感染气管黏膜中在1-21 dpi均显著上调表达,但在肾脏中大部分变化不明显,TLR3蛋白均表达和分布于这两种组织;IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达在M41株感染气管黏膜以及GX-YL5株感染气管黏膜和肾脏组织中显著上调;IFN-α在气管黏膜上调而在肾脏下调,IFN-β主要在M41株感染气管黏膜和GX-YL5株感染肾脏组织表达,ISG在M41株和GX-YL5株感染的气管黏膜和肾脏组织均显著上调。本研究表明M41株和GX-YL5株感染引起的气管黏膜和肾脏组织病理变化程度与病毒载量呈正相关,TLR3和TLR7信号通路应答存在组织差异,IL-1β和IL-6表达与组织炎症损伤相关,IFN-α表达存在组织差异,IFN-β表达既存在组织差异又存在毒株差异,ISG均上调表达从而发挥抗病毒效应。本研究解析了不同IBV感染对靶组织TLR3和TLR7信号通路的不同影响,为不同致病型IBV毒株感染的天然免疫应答提供科学依据。二、IBV感染对核转录因子IRF7和NF-KB p65表达的影响核转录因子是宿主天然免疫TLR和RLR信号通路的关键信号分子,负责启动Ⅰ型IFN、促炎症因子和趋化因子的转录。为了探讨IBV感染对核转录因子IRF7和NF-κB p65的影响,为IBV致病及免疫机制研究提供理论依据,本研究分别应用荧光定量PCR和Western Blot检测IBV M41和GX-YL5株感染SPF鸡气管和肾脏组织IRF7和NF-κB p65的mRNA和蛋白表达水平,以及应用免疫组织化学方法观察IRF7和NF-κB p65在气管和肾脏组织的分布,同时检测IBV的N蛋白表达变化。结果显示,M41株感染3-8 dpi气管黏膜和肾脏组织中IRF7的mRNA和蛋白表达显著上调和明显上升;GX-YL5株感染气管黏膜和肾脏组织中IRF7的mRNA和蛋白在1-21 dpi均显著上调和上升。M41株感染早期气管黏膜中NF-κB p65的mRNA和蛋白表达显著上调和明显上升;GX-YL5株感染气管黏膜中NF-κB p65的mRNA和蛋白在1-3 dpi显著上调和上升；但M41和GX-YL5株感染后肾脏组织中NF-κB p65的mRNA显著下调或变化不明显,Western Blot未检测到NF-κB p65蛋白。免疫组化的结果显示IBV感染后气管黏膜和肾脏组织中IRF7和NF-κB p65的蛋白表达明显上升,与病毒载量和N蛋白变化一致,在病毒复制高峰期IRF7和NF-κB p65大量转移至细胞核。本研究表明M41和GX-YL5毒株感染均激活了IRF7和NF-κB p65信号,IRF7和NF-κB p65在抗IBV天然免疫反应中发挥重要作用。三、Viperin和IFIT5对IBV体外复制的影响第二章的研究发现IBV感染激活SPF鸡气管黏膜和肾脏组织的天然免疫TLR3和TLR7信号通路,诱导Ⅰ型IFN表达,同时显著上调包括Viperin和IFIT5在内的多种ISG mRNA表达。在此基础上,本部分进行Viperin和IFIT5对IBV体外复制的影响。首先对CEK和DF1细胞感染IBV后Viperin和IFIT5 mRNA的表达动态进行分析,然后通过在DFI细胞瞬时过表达鸡Viperin和IFIT5蛋白以及shRNA慢病毒感染干扰鸡Viperin和IFIT5的mRNA表达后感染IBV M41和GX-YL5毒株,根据病毒RNA载量及N蛋白表达变化来评估Viperin和IFIT5蛋白对IBV复制的影响。结果显示,M41和GX-YL5毒株感染后6-72 h,CEK和DF1细胞中Viperin和IFIT5的mRNA表达极显著上调,二者mRNA表达峰值与病毒RNA峰值基本一致。DF1细胞过表达Viperin和IFIT5蛋白后能够同时显著降低M41毒株的RNA和N蛋白表达,过表达IFIT5蛋白只明显降低GX-YL5毒株N蛋白表达,但未能降低其RNA载量;过表达Viperin对GX-YL5毒株RNA载量和N蛋白的影响均不明显。敲低鸡Viperin表达同时促进IBV的RNA复制和N蛋白表达,敲低鸡IFIT5表达明显促进N蛋白表达,但不影响病毒RNA复制。结果表明,鸡Viperin和IFIT5参与IBV诱导的天然免疫反应,具有抗IBV体外复制的功能。综上所述,本研究表明IBV呼吸型M41株和肾型GX-YL5株感染均激活气管和肾脏的TLR3和TLR7信号通路,活化核转录因子IRF7和NF-κB p65,诱导促炎症及抗炎症细胞因子、Ⅰ型IFN和ISG表达,表明天然免疫反应在IBV感染早期发挥重要抗病毒作用,但不同毒株和组织之间的免疫应答存在差异性。鸡Viperin可同时抑制M41毒株的RNA复制和蛋白表达,鸡IFIT5通过可抑制IBV蛋白表达,发挥抗IBV复制的作用。本研究为IBV致病及免疫机制研究提供理论依据,为不同致病型IBV毒株感染的天然免疫应答和调节提供了独特的见解,也为抗IBV感染药物研究提供参考。