论文部分内容阅读
利用生物修复法来降低环境中的农药是行之有效的措施之一,在诸多的农药生物修复方法中以微生物修复的研究和应用最为广泛,尤其微生物修复环境中长残效农药的研究较多。甲嘧磺隆是一种超高效、广谱、持效期长的磺酰脲类除草剂,在世界范围内广泛应用于林业及非耕地杂草的防除。甲嘧磺隆性质稳定、不易降解、在环境中持效期长,因此对敏感作物很容易造成药害。甲嘧磺隆的水溶性较高,在土壤中的移动性较强,易造成对地下水的污染,因此,对甲嘧磺隆微生物降解作用的研究具有一定的实践意义。而关于甲嘧磺隆的微生物降解作用研究鲜见报道,本研究通过富集培养的方法从土壤和水中分离筛选出19株可降解甲嘧磺隆的微生物,对其中降解能力较强的JH2和JH3菌株进行了降解特性及降解机理研究,主要研究结果如下:1.降解甲嘧磺隆微生物的筛选。利用富集培养技术从生产甲嘧磺隆农药厂的废水中分离得到了19株能够降解甲嘧磺隆的微生物,通过测定不同菌株对甲嘧磺隆的降解率发现:供试菌株对低浓度甲嘧磺隆的降解率要显著高于高浓度的降解率,在培养基中甲嘧磺隆的含量为5 mg·L-1时,JH3菌株的降解率最高,为98.9%,其次是JH2菌株,降解率为95.3%。对其中降解作用较强的7个菌株进行鉴定,其中JH3菌株为睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）;JH2菌株为食酸丛毛单胞菌（Delftia subsp）;JH10菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;JH6菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）;SH3菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;SH5菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;SH4菌株为沙门氏菌（salmonella sp.）。2. JH2、JH3菌株的降解特性及降解机理研究。结果表明,JH2菌株的最适降解培养基为基础培养基Ⅲ,以甲嘧磺隆浓度为5 mg·L-1时JH2、JH3菌株降解率最高;JH2菌株对甲嘧磺隆降解的适宜温度为30℃,JH2菌株接种量为1×108 CFU·mL-1,转速为150 r·min-1,培养120 h对甲嘧磺隆的降解率最高;JH3菌株对甲嘧磺隆降解的适宜温度为35℃,接种量为1×107 CFU·mL-1,转速为150 r·min-1,培养72 h时对甲嘧磺隆的降解率最高;通过对JH2、JH3菌株进行作用机理研究,两菌株降解产物的特征峰基本相同,降解产物的主要碎片离子为m/z198、分子式为C8H7O4S的化合物,其紫外检测的保留时间为3.0 min,推断甲嘧磺隆结构式中的另一半结构可能降解为链状烷烃,没有紫外吸收,也不能离子化,因此没有特征峰。以此判断JH2、JH3对甲嘧磺隆降解的作用位点在S-N键。3. JH2、JH3菌株降解酶活性研究。通过JH2、JH3菌株对甲嘧磺隆降解酶定域表达试验表明,两菌株的胞内酶和胞外酶均有活性,降解甲嘧磺隆的关键酶都主要是胞外酶且降解酶诱导表达。在LB液体培养基中,当甲嘧磺隆浓度为5 mg·L-1、接种量为2.3×108 CFU·mL-1、初始pH值为8.0、温度30℃、转速为150 r·min-1、培养时间120 h时JH2菌株胞外粗酶的酶比活最高达到85.8 U·mg-1;其酶促反应体系的甲嘧磺隆最适浓度为5 mg·L-1、温度30℃、pH值为8.0时胞外酶对甲嘧磺隆的降解率最大为86.9%。在LB液体培养基中,当甲嘧磺隆浓度为5 mg·L-1、接种量为2.3×107 CFU·mL-1、初始pH值为9.0、温度35℃、转速为150 r·min-1、培养时间72 h时JH3菌株胞外粗酶的酶比活最高达到88.4 U·mg-1;酶促反应体系的甲嘧磺隆最适浓度为5mg·L-1、温度35℃、pH值为9.0时胞外酶对甲嘧磺隆的降解率最大为91.3%。两菌株甲嘧磺隆降解酶在25℃ 45℃范围内热稳定性较好,pH值为7 9碱性条件下能够保持较高降解活性。4. JH2、JH3菌株降解甲嘧磺隆活性酶的纯化。胞外粗蛋白经过DEAE SepHarose Fast Flow阴离子交换柱分离,在280 nm下JH2菌株得到5个蛋白吸收峰,降解圈法检测发现3个洗脱峰P1-1、P1-3、P1-5均有降解活性;JH3菌株得到2个蛋白吸收峰,降解圈法检测发现仅P2-2洗脱峰具有降解活性;SDS-PAGE电泳检测P1-1、P1-3、P1-5和P2-2的分子量分别是43 kDa、32 kDa、15 kDa和46 kDa。将甲嘧磺隆降解酶P1-1、P1-3、P1-5和P2-2利用生物质谱技术测定了氨基酸序列,得到4种降解酶分别为:信号转导组氨酸蛋白激酶、预苯酸脱氢酶、未知蛋白和糖基转移酶。根据得到的编码氨基酸的基因序列设计合成了简并引物,通过PCR分别从JH2、JH3菌株基因组中克隆出甲嘧磺隆降解酶基因G1-1、G1-3、G1-5和G2-2,编码基因全长分别是1191 bp、886 bp、415 bp、1274 bp;G1-1、G1-3、G1-5和G2-2分别与载体PMD19-Vector连接转入大肠杆菌,筛选得到阳性克隆并测序,通过Blast软件分析,所得结果与已测序得到的编码氨基酸的基因序列基本吻合。5.降解甲嘧磺隆微生物菌剂加工及应用的研究。本论文初步研制出JH2、JH3菌株的水剂和颗粒剂配方,筛选出了对甲嘧磺隆敏感的植物是小麦,生物活性测定甲嘧磺隆对小麦的IC50值为0.014 mg·kg-1。在分别使用JH2和JH3菌株水剂20 d和15 d后能将土壤中甲嘧磺隆浓度为5 mg·kg-1和1 mg·kg-1的残留降解为对小麦无明显药害水平,通过HPLC检测处理后土壤中的甲嘧磺隆发现,土壤中甲嘧磺隆残留量小于0.0077 mg·kg-1,降解率达到了99%以上。