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MicroRNA-155在肾透明细胞癌中的表达以及对人肾癌细胞株ACHN生物学性状影响的实验研究研究背景：肾癌（renal cell carcinoma, RCC）是常见的泌尿系恶性肿瘤,发病率仅次于膀胱癌,位居第二,其发病率占成人恶性肿瘤的2%-3%,其中肾透明细胞癌（clear renal cell carcinoma, ccRCC）占70%～80%左右。全世界肾癌发病率每年增加2%,每年死于肾癌者近100000例。肾癌早期无症状,约50%的患者首次就诊时已经属于晚期,进展期肾癌的5年生存率低于10%。在我国,近年来肾癌的发病率有上升的趋势,严重威胁者人民的生命健康安全,但是我们对肾癌的发病机制尚缺乏全面和深入的了解。和其他的肿瘤相比,肾癌恶性程度高,传统的治疗方法除外科手术外,化疗、放疗、免疫治疗等并不能起到良好的治疗效果。因此阐明发病机理、寻找新的治疗手段仍然是泌尿外科的热点课题。微小RNA （microRNA或miRNA）是一类近年来发现的长度为21～25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子,miRNA可通过与靶mRNA的3’非编码区结合,可以在转录后水平通过促进靶mRNA降解和／或抑制其翻译而发挥负调控基因表达的作用。miRNAs广泛地参与调节细胞的增殖、分化、凋亡,以及个体发育、机体代谢等过程。研究发现,miRNAs在不同的肿瘤组织中表达水平不同,有些表达水平明显低于正常组织,有些则明显的上调,这些表达异常的miRNAs可能与肿瘤的发生有着密切的关系,并在肿瘤的发生发展中起着癌基因或抑癌基因的作用。目前认为,引起miRNA在肿瘤细胞中表达水平发生改变的可能原因有染色体重组、基因扩增、突变及表观遗传学改变等。miR-155,定位于人染色体21q21,由BIC基因编码。人类BIC基因含3个外显子,其中第3个外显子高度保守的区域编码miR-155。miR-155是一个典型的多功能基因,由其下游基因介导,参与多种生理病理过程,如肿瘤的发生、发展,炎症和免疫,其在人类多种恶性肿瘤中高表达,如非小细胞肺癌,乳腺癌,胰腺癌等。研究表明在很多肿瘤中miR-155作为癌基因发挥功能。尽管miR-155功能和表达的调节机制仍然不甚清楚,但是在多种肿瘤组织中的过表达让我们意识到其在肿瘤诊断和治疗中的巨大潜力。为了探索miR-155与肾透明细胞癌发生、发展的关系,我们用实时实时定量PCR技术检测其在肾透明细胞癌及癌旁非肿瘤组织中的表达情况,研究其与临床分期、病理分级之间的关系。同时检测各肾癌细胞株中miR-155的表达情况,筛选合适的体外肾癌细胞模型,研究其对肾癌细胞的生物学行为的影响,如增殖能力,侵袭能力等。继之用生物信息学预测miR-155可能的靶基因,并进行了初步的实验验证,探讨其在肾癌中可能的作用机制,为肾癌的早期诊断和治疗提供新的思路。第一章miR-155在人肾透明细胞癌中的表达情况及其与临床分期、病理分级的关系研究目的：探讨miR-155在肾透明细胞癌中的表达及其意义。方法：用实时定量PCR技术检测16例ccRCC及癌旁非肿瘤组织中miR-155的表达情况,研究其与ccRCC临床分期、病理分级之间的关系。结果：实时定量PCR结果发现,在16例ccRcc患者中,与配对的癌旁非肿瘤组织相比,肿瘤组织中miR-155的表达在94%（15例）的样本中上调,仅在一例样本中下调,其中ccRCC中miR-155的相对表达量为2.08～26.05,平均12.70±6.52,癌旁非肿瘤组织中相对表达量为1.00-6.79,平均2.82±1.25,改变有显著统计学差异（P<0.05）。16例ccRCC标本中,根据病理分级样分组,高分化组miR-155的相对含量为11.43±6.18,中-低分化组为14.33±7.04,没有显著差异（P>0.05）。在不同临床分期组合样本中,Ⅰ期miR-155的相对含量为13.50±6.55,Ⅱ-Ⅲ期为10.93±6.79,没有显著差异（P>0.05）结论：1、ccRCC患者癌组织中的miR-155的表达水平较癌旁非肿瘤组织明显上调,提示miR-155的表达上调可能与ccRCC的发病机制相关。2、在ccRCC患者中,miR-155的表达的表达水平与ccRCC的病理分级及临床分期组合无显著相关性。第二章microRNA-155对肾癌细胞生物学性状的影响目的：探讨miR-155对肾癌细胞生物学性状的影响,包括细胞增殖,细胞凋亡和细胞侵袭能力的影响。方法：检测肾癌细胞株（ACHN和KC细胞）中及正常肾小管上皮细胞株（HK2）中miR-155的表达情况,结合细胞的增殖和分化特征,筛选合适的肾癌细胞株。使用LipofectamineTM 2000转染hsa-mir-155 inhibitor于肾癌细胞株,敲低miR-155的表达,实时定量PCR检测转染后miR-155表达,MTT法、Annexin V/PI双染法和Transwell侵袭实验分别观察细胞增殖、凋亡及侵袭能力的变化。结果：肾癌细胞株ACHN、KC细胞,正常肾小管上皮细胞株HK2的miR-155的相对表达量分别为9.3,3.0和1.0。选择ACHN细胞株作为体外细胞模型。实验分为正常细胞组,阴性对照组,miR-155抑制组3组。成功转染ACHN细胞,结果显示抑制组中miR-155的相对含量为1.25±0.22,阴性对照组为7.03±0.18,有显著性差异.（P<0.05）。用MTT法检测细胞的生长抑制率,流式细胞术检测其凋亡率,细胞侵袭实验检测其侵袭能力,发现转染48小时后,抑制组细胞的相对存活率66.6±1.0%,阴性对照组为97.1±1.5%,有显著性差异（P<0.05）；抑制组ACHN细胞的凋亡率为13.76±0.86%,而正常组和阴性对照组的凋亡率分别为5.98±0.44%和7.16±1.07%,有显著性差异（P<0.05）; Transwell侵袭实验结果显示侵袭细胞数正常组42..17±1.38,对照组41.22±1.65,抑制组14.74±1.06,抑制组相对于正常组和对照组有显著性差异（P<0.05）。结论：1、hsa-mir-155 inhibitor能有效的转染于ACHN细胞,降低ACHN细胞中miR-155的表达。2、miR-155的低表达能使ACHN细胞增殖受到抑制,凋亡率增加,同时细胞的侵袭能力减弱。3、miR-155在肾癌中可能起着癌基因的作用,通过抑制其表达,有望达到治疗肾癌的目的第三章microrna-155影响肾癌细胞的机制探讨目的：探讨miR-155影响ACHN肾癌细胞的分子学机制方法：通过生物信息学方法（如miRanda, Pictar, Targetscan）预测microrna-155的靶基因,用实时定量PCR及Western blot分别检测对照组和抑制组中的miR-155的表达量及靶基因蛋白的表达,初步探讨敲低microrna-155对抑制肾癌细胞生长的作用机制。结果：选择TargetScan、PicTar和miRanda这3个软件对miR-155进行靶基因预测,发现SOCS-、BACH1和RAB34为miR-155可能潜在的靶基因。运用实时定量PCR技术,检测转染后抑制组和阴性对照组中ACHN中miR-155的相对含量,以U6作为内参。结果显示抑制组中miR-155的相对含量为1.25±0.22,阴性对照组为7.03±0.18,有显著性差异（P<0.05）。Western blot显示SOCS-1的蛋白表达比值（SOCS-1/GAPDH）在阴性对照组和抑制组中分别为0.053±0.015和0.047±0.006,无显著性差异（P>0.05）。BACH1的蛋白表达比值（BACH1/GAPDH）分别为0.125±0.005和0.376±0.015,有显著性差异（P<0.05）。RAB34的蛋白表达比值（RAB34/GAPDH）分别为0.164±0.015和0.399±0.091有显著性差异（P<0.05）。结论：1、ACHN细胞中miR-155的表达与BACH1和RAB 34蛋白表达呈负相关性,而与SOCS1蛋白表达无明显关系。2、BACH1、RAB 34可能为miR-155潜在的靶基因,而SOCS1非miR-155的靶基因。