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动脉粥样硬化是一种分布于大中型动脉壁的血管病变,是冠心病、脑血管病等缺血性心脑血管疾病的主要病理基础,其并发症是现今发达国家最常见的死因,而近年来我国动脉粥样硬化发病率也在逐年增高。因此如何控制动脉粥样硬化斑块的进展,是一个亟需解决的问题。PGC1α是一种转录共激活因子,是许多细胞和器官水平稳态机制的核心。近年来PGC1α在血管调控中的作用引起了广泛的关注。PGC1α对血管具有一定的保护作用,但其中的分子机制仍有待进一步阐明。miRNA是一类内源性短链非编码RNA,约19-22个核苷酸,通过其种子序列互补结合来识别目标信使RNA,直接切割靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译,从而调控转录后基因的表达。近年来的研究也表明miRNA在维持心血管系统的稳态中发挥着重要的作用。研究表明,miR-378a在心血管中大量表达,并发挥着调节心肌发育的作用,但miR-378a在动脉粥样硬化中发挥的作用尚不明确。1.研究材料和方法1.1临床样本的收集和细胞培养在动脉粥样硬化患者行冠状动脉旁路移植术以及主动脉修复手术过程收集的主动脉壁、斑块组织。同时收集主动脉瓣狭窄患者的主动脉壁组织作为正常对照组织。新鲜标本收集后迅速保存于液氮而后转移至-80℃冰箱中。人主动脉平滑肌细胞HASMC由美国Sciencell公司提供。1.2过表达PGC1α的血管平滑肌细胞中差异表达miRNAs的筛选以及目标miRNA的选择与验证采用生物芯片初步筛选在过表达PGC1α的血管平滑肌中表达水平显著改变的miRNAs,并进行验证,最终选定表达差异最为显著的miR-378a作为目标miRNA。随后在临床动脉粥样硬化患者血管壁、斑块组织以及过表达PGC1α人主动脉平滑肌细胞中对miR-378a的表达差异进行进一步验证,同时分析miR-378a与PGC1α之间的相关性。1.3 miR-378a对人主动脉平滑细胞的增殖、迁移和炎症的影响通过转染使miR-378a在人主动脉平滑肌细胞中表达水平增加,利用不同分子生物学和显微成像技术,观察人主动脉平滑肌细胞的增殖（细胞计数、Ed U法）、迁移（Transwell法）和炎症（q RT-PCR和ELISA）等细胞功能学的改变。1.4 miR-378a下游靶点IGF1以及TLR8的验证应用生物信息学网站miRBase、Target Scan以及miRanda,分析出相关因素,再采用RNAhybrid来计算IGF1以及TLR8具有作为miR-378a下游靶点的可能性。而后利用荧光素酶报告基因实验验证miR-378a对IGF1以及TLR8的负调控作用,使用Western Blot实验检测过表达miR-378a的人主动脉平滑肌细胞中下游靶基因IGF1以及TLR8的蛋白水平。检测动脉粥样硬化患者的主动脉壁以及斑块组织中,IGF1以及TLR8的蛋白水平,并分析其和miR-378a的表达水平的相关性。1.5 miR-378a调控下游直接靶点IGF1以及TLR8对人主动脉平滑肌细胞的生物学功能的研究利用不含3’UTR区的IGF1以及TLR8过表达质粒来提高人主动脉平滑肌细胞的IGF1以及TLR8的表达水平,并使用各种分子生物学和显微成像技术,观察人主动脉平滑肌细胞的增殖（细胞计数、Ed U法）、迁移（Transwell法）和炎症（q RT-PCR和ELISA）等细胞功能学的改变。此外本课题通过在已经过表达miR-378a的人主动脉平滑肌细胞中过表达IGF1以及TLR8来探究miR-378a对人主动脉平滑肌细胞的增殖、迁移和炎症的抑制作用是否能够被逆转。2.主要研究结果2.1 miR-378a在过表达PGC1α的人主动脉平滑肌细胞中表达显著上升。动脉粥样硬化患者主动脉壁及斑块组织中PGC1α以及miR-378a的表达水平均显著下降,且两者表达水平呈正相关性,PGC1α可以通过转录因子NRF1来调控miR-378a的表达。2.2外源性过表达miR-378a能显著抑制人主动脉平滑肌细胞的增殖、迁移以及炎症反应的发生。2.3 IGF1以及TLR8是miR-378a的直接下游靶点。IGF1和TLR8在动脉粥样硬化患者主动脉壁以及斑块组织中的表达显著上升。miR-378a的过表达能明显抑制IGF1以及TLR8的表达水平,且动脉粥样硬化患者主动脉壁以及斑块组织中的miR-378a表达水平与IGF1以及TLR8表达水平均呈负相关。2.4 IGF1以及TLR8的过表达能够促进人主动脉平滑肌细胞的增殖、迁移以及炎症,与抑制miR-378a作用相似。并且,在过表达miR-378a的基础上过表达IGF1和TLR8能部分或完全逆转miR-378a对人主动脉平滑肌细胞的增殖、迁移和炎症反应的抑制作用。3.结论3.1 PGC1α和miR-378a在动脉粥样硬化患者主动脉壁及斑块组织内的表达水平显著下降,并且两者表达水平呈正相关性,PGC1α可以通过转录因子NRF1来调控miR-378a的表达。3.2过表达miR-378a能明显抑制人主动脉平滑肌细胞的增殖、迁移和炎症反应,而其抑制作用可以被其下游直接靶点IGF1和TLR8的过表达逆转,提示miR-378a可能是通过调控下游IGF1以及TLR8的表达来参与动脉粥样硬化的发生发展过程。3.3 miR-378a的表达水平在动脉粥样硬化患者主动脉壁、斑块组织及正常对照组织中有着显著差异,且miR-378a与其下游直接靶点IGF1以及TLR8在动脉粥样硬化患者主动脉壁以及斑块组织中表达水平呈现负相关性,提示miR-378a、IGF1以及TLR8均有可能成为动脉粥样硬化的诊疗靶点。