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肉毒毒素(botulinum neurotoxin,BoNT)是一类由肉毒梭菌产生的神经毒素,为已知毒性最强的物质,通过阻断神经-肌肉突触传递引起松弛性麻痹发挥毒性作用。肉毒毒素包括A-G 7种血清型,其中A、B、E和F能够引起人类肉毒中毒,目前还没有小分子药物可以用于治疗肉毒中毒[1],主要采用马源抗毒素血清进行治疗,但由于可能存在血清病毒污染、过敏反应、生产周期长、费用高等因素使得这种治疗方法的应用受到限制。因此考虑制备人源化中和抗体作为治疗手段,但BoNT中和表位的免疫原性比其他表位弱,因而以Hc作为抗原筛选抗体时,更容易筛选到针对非中和表位优势表位的抗体。另外,类毒素免疫原不能模拟毒素的中和表位,毒素的中和表位并不单一,必须封闭多个表位毒素才能被中和,这些因素使单克隆中和抗体的研究成了难题。重链C端Hc(868-1296)是BoNT/A的抗原决定区,具有完全保护效应,BoNT/A的受体结合区域也位于Hc结构域,一致认为中和抗体是因为阻碍毒素与受体结合而抑制毒素的毒性,因此,明确BoNT/A的受体结合位点可望为有效的中和抗体的筛选提供依据。BoNT/A的受体是神经节苷脂GT1b与突触囊泡蛋白SV2。GT1b的结合位点主要是H1253、S1264、W1266、Y1267这些部位的氨基酸残基[2]。SV2分为A-C3种亚型,以SV2C与BoNT/A结合力最强[3]。BoNT的蛋白受体研究曾经一直是一个难题,直到2006年,Dong等人发现BoNT/A的蛋白受体是SV2,之后几年BoNT的蛋白受体才相继明确。然而除通过共结晶明确了BoNT/B、BoNT/G与其蛋白受体SytII的结合细节[4-6]之外,其他BoNT与其蛋白受体的结合位点目前仍然没有任何报导。本研究旨在通过明确BoNT/A的SV2结合位点,构建只包含BoNT/A受体结合区域的抗原,利用该抗原筛选噬菌体抗体,获得针对BoNT/A受体结合区域的单克隆中和抗体。进行了BoNT/A重链的表达。目前尚无关于BoNT/A高效表达的报导[7, 8],根据大肠杆菌偏好密码子合成了毒素重链N端编码序列,与C端编码序列进行重叠延伸PCR连接重链基因,构建至pTIG-TrxA载体在BL21(DE3)中进行表达。表达条件考察发现静置培养表达水平远远高于摇床培养,静置条件下培养基体积在5-15mL时,重链表达水平与培养基体积呈S型曲线关系,表达水平达到64.7mg/mL。采用双拷贝的硫氧还蛋白还原酶(TrxA)基因与重链共表达,以增加表达系统的还原性,结果显示,增加TrxA基因后,重链表达对厌氧环境的依赖下降且表达量明显升高。但全长重链表达质粒在表达过程中存在不稳定现象,且纯化困难,而Hc表达量及纯化纯度(>90)均较高,因此主要用Hc进行受体及中和抗体研究。进行了Hc及其受体基因的分离、表达和纯化。从大鼠脑组织中获得SV2C的基因,在大肠杆菌中进行表达纯化,用GST pull-down的方法检测SV2C与BoNT/A-Hc不同截短突变体间的相互作用,初步确定BoNT/A的SV2C结合区域是1150-1219位氨基酸残基之间;在截短突变体相互作用结果的基础上构建小片段缺失突变体,检测与SV2C相互作用,缩小可能的相互作用区域范围至1173-1213位氨基酸残基之间;最后根据缺失突变体相互作用结果构建Ala突变体,检测Ala突变体与SV2C相互作用,从而确定BoNT/A的SV2C结合位点是1179-1181和1191-1193位氨基酸残基。BoNT/A的三维结构图显示,这6个氨基酸残基形成两个空间上相邻的线性表位,形成BoNT/A与神经节苷脂受体结合的口袋结构的反面的一个口袋结构的底部。将7个血清型的BoNT序列对比发现1180位V在A型与E型中保守,1191-1193(YRL)在A型与F型中保守,这与最近发现A型与E、F型的蛋白受体是SV2具有相关性。用纯化的Hc作为抗原,对库容量为1.35×1010的大容量全合成人源噬菌体单链抗体库进行了初步筛选,共鉴定约1000个克隆,获得300个左右的阳性克隆。根据研究所得BoNT/A的蛋白受体结合位点构建BoNT/A的SV2C结合区域和GT1b结合区域的融合蛋白Hc-sg,进行表达纯化,用该融合蛋白作为抗原,进行与阳性克隆的ELISA反应,鉴定抗体特异性同时筛选针对受体结合表位的抗体。虽然Hc纯度达到95%以上,但仍然有90%的克隆可以和大肠杆菌菌液反应,对其他无关抗原具有较好特异性。从300多个克隆中挑选出14株即可与Hc反应,又可与Hc-sg结合,且特异性较好的抗体进行测序,得到13株具有不同序列的单链抗体,重链框架均为H3,轻链框架有3株为λ3,其余为λ1。针对肉毒毒素多抗原表位特点,选择了7株特异性较好的抗体,将VH与Vλ编码序列分别构建到带恒定区的重链表达载体h293与λ链表达载体L293-CL,构建成全抗体表达质粒,转染至293-F细胞进行瞬时表达。对表达全抗体的细胞上清进行Protein A柱纯化,抗体获得了富集。将抗体进行了初步中和活性检测,结果显示,得到了一个有望具有较强中和活性的抗体2F3。C25、S25、3D12是目前已获得的针对BoNT/A的有效单克隆中和抗体,3株联用体内中和效果可以达到450, 000LD50[7],这三株单克隆抗体的表达可以为今后的BoNT/A相关中和实验及所筛选BoNT/A中和效果的评价提供便捷的工具。本实验按哺乳动物偏好密码子设计合成S25与3D12的可变区编码序列,κ链可变区序列构建到带有轻链恒定区的载体L293-CK,重链可变区构建到带有重链恒定区的载体H293,轻、重链载体共转染至293-F细胞,瞬时表达;用Hc及S25与3D12的中和表位突变的Hc与瞬时表达上清进行ELISA检测,结果显示3D12未表达,S25表达成功。根据蛋白质晶体结构中BoNT/A与抗体AR2、CR1复合物结构为模型,用Modeler软件同源模建了BoNT/A与C25的结合,并且进行实验验证,发现可能的结合位点全部覆盖了文献报导的BoNT/A的C25结合位点,今后所表达单克隆抗体与BoNT/A的结合可以此结构为模型进行预测。本文研究了重链及其C端高效表达的方法,明确了BoNT/A的SV2C结合位点,构建了只包含受体结合区域的BoNT/A抗原肽,筛选得到针对Hc受体结合区域特异性较强的单克隆抗体,成功表达了7株scFv以及S25的全抗体,获得了可能具有一定中和活性的抗体2F3,并对BoNT/A与C25的结合进行了模建及实验验证。