第一部分短暂阴囊热激影响精子发生的临床研究目的:前瞻性地探究短暂阴囊热激对男性精液质量、精子功能、精子DNA完整性、精浆生化及精子蛋白表达水平的影响,评估不同热激频率对精子发生损伤的严重程度。方法:招募20名健康成年男性志愿者并随机分为两组,分别接受不同频率睾丸热激(热水浴)。第一组志愿者每天热激一次,每次30分钟,连续10天;第二组每三天一次,每次30分钟,共10次。所有志愿者于热激前、及热激开始后每隔2周取精液进行精液常规、精子顶体酶活性、附睾及附属性腺功能、氧化应激水平、精子线粒体膜电位、精子DNA损伤,以及与缺氧、热休克和精子线粒体及鞭毛功能密切相关的蛋白水平检测;每隔3周取静脉血进行性激素水平检测。所有志愿者热激后共监测随访16周。结果:两组志愿者的精子浓度、活力、总数、存活率、顶体酶活性在热激后均出现显著性降低,至6-8周降至最低后开始恢复。第一组志愿者精子浓度于第8周降至热激前的28.8%,而第二组志愿者降低至热激前的15.5%,第二组的精子浓度最低值明显低于第一组(p=0.031)。精浆锌、果糖浓度及中性α糖苷酶活性在热激后无显著变化。精浆抗氧化酶如SOD、CAT活性在热激后也无显著变化,而脂质过氧化产物MDA的浓度显著升高。精子线粒体膜电位异常率、凋亡率及DNA碎片指数DFI、高DNA可染性HDS等指标均在热激后出现显著性升高。第一组志愿者精子线粒体膜电位异常率及凋亡指数最高值显著高于第二组(p值分别为0.026,0.007),但在第二组中上述指标恢复更慢。精浆游离Fas浓度在第一组志愿者热激后第2周出现显著性升高(p=0.036),而其他各时间点与热激前相比均无明显变化。精子Bcl-2蛋白表达在热激后第6-10周出现显著性下调,而与热休克相关的蛋白HSP70和HSF1,以及线粒体结构及功能蛋白MFN2的表达在热激后显著上调(p值分别为0.017,0.005及0.012),鞭毛结构功能相关蛋白 SPAG6的表达在热激后第6-10周出现显著下调(p=0.012)。监测结束时(热激后第16周),上述所有指标均恢复至热激前的水平。性激素水平在热激前后各时间点均无明显变化。结论:短暂阴囊热激导致精子浓度、总数、活力、存活率、顶体酶活性的显著降低,而在一个生精周期后均恢复至热激前的水平。间断热激比连续热激对精子发生的抑制效应更明显。对性激素水平,附睾及附属性腺功能无明显影响。热激导致精子DNA损伤及凋亡,与间断热激相比,这一现象在连续热激中更为严重。生精细胞和精子的凋亡主要是通过线粒体依赖的途径实现的,Fas/FasL途径可能并不起关键作用。阴囊热激能够引起一系列的分子应答,包括与热休克、精子线粒体功能、鞭毛结构和功能等密切相关的蛋白水平的变化。这些蛋白水平的变化可能在热激诱导的精子发生损伤中起着重要的作用。第二部分热激损伤猕猴精子发生的蛋白质组学研究目的:在第一部分临床试验的基础上,进一步从睾丸组织学角度,运用蛋白质组学方法探究猕猴睾丸组织在热激前后的蛋白表达差异,寻找热激导致生精损伤的蛋白靶点。方法:对8只成年雄性猕猴进行阴囊热激,每天一次,每次30分钟,连续6天。于热激处理2周前及热激开始后第8,15,30,45,60,75及90天分别取静脉血,精液及睾丸活检组织,进行精液常规,性激素水平检测及睾丸组织形态学和凋亡检测。将热激前(D0)及热激开始后第8天(D8)及第60天(D60)的睾丸活检组织提取的蛋白分别取等量进行混合,运用iTRAQ差异蛋白质组技术鉴定并筛选猕猴睾丸组织在D8与D0之间的差异蛋白,以及D60与D0之间的差异蛋白,并运用生物信息学方法分析差异蛋白参与的生物学过程,分子功能和细胞定位,以及可能的信号通路,再挑选部分关键蛋白进行验证。结果:热激前猕猴精子浓度为66.5±13.0×106/ml,从热激开始后第15天起精子浓度开始明显下降,至第30天及第45天分别降至0.5±0.3×106/ml及无法检测出(几乎为0)(与热激前相比p<0.01)。于.第60天恢复至热激前的水平(81.0±20.2× 1 06/ml)。精子前向运动活力也呈现类似的可逆性变化。热激开始后第8天各级生精细胞排列开始出现紊乱,凋亡明显增多,与热激前相比,共有105种蛋白表达出现差异(倍数变化大于1.5或小于0.67,p<0.05)。其中表达上调的蛋白36种,下调的蛋白69种。这些蛋白主要的生物学功能包括与核酸结合及非折叠蛋白结合等。在对差异蛋白进行KEGG通路富集后,找到了 14条差异蛋白白可能参与的主要通路,包括剪接体、细胞凋亡、内质网蛋白质加工、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等。第60天与热激前相比,差异表达的蛋内共26种,其中上调的有24种,下调的有2种。这些差异蛋白的主要分子功能为与酶、蛋白及多糖等结合,对其生物活性进行调控。KEGG通路富集发现,差异蛋白主要参与补体与凝集反应、TGF-β信号通路、细胞粘附、氧运输及PPAR信号通路。运用免疫组织化学及western blot对部分差异蛋白进行验证,发现热激后CIRBP、PSIP1及sam68出现显著下调,而Decorin呈现显著上调,这与蛋白质组学结果一致。结论:短暂阴囊热激也可导致猕猴精子发生出现严重而可逆性的损伤,在损伤早期及恢复期多种蛋白的表达水平出现差异。部分差异蛋白如CIRBP、PSIP1及Sam68的表达在热激后显著下调,Decorin在热激后显著上调,上述蛋白可能在热激导致的精子发生损伤中发挥了重要的作用。第三部分TGF-β对睾丸热激后CIRBP表达的调控作用目的:第二部分蛋白质组学研究发现CIRBP在睾丸热激后表达显著下调,本研究将探索TGF-β在睾丸热激前后的表达变化,及其对CIRBP的调控作用。方法:本研究分为在体和体外试验。在体试验中,首先构建ICR小鼠睾丸热激模型,将小鼠睾丸在43℃水浴中热激处理30分钟,24小时后取睾丸组织,real-time PCR及Western blot检测TGF-β1,TGF-β2及TGF-β3的表达水平。睾丸热激后,再局部注射TGF-β拮抗剂(非选择性受体抑制剂),24小时后检测CIRBP的表达变化,评估TGF对CIRBP的调控作用。体外试验中,在小鼠精母细胞系GC2-spd培养基中加入不同亚型的TGF-β,培养48小时后检测CIRBP的表达水平。结果:小鼠睾丸热激后24小时,real-time PCR及Western blot结果均发现TGF-β2及TGF-3的表达水平较对照组显著上调(p<0.05),而TGF-β1的表达虽有上调趋势但与对照组相比差异无统计学意义。睾丸热激后CirbpmRNA表达对照组相比显著下调(p=0.003),热激并在局部注射低剂量TGF-β拮抗剂LY2109761(5μg)之后,其表达水平呈现上升的趋势,但差异无统计学意义(p=0.36),且仍显著低于对照组表达水平(p=0.048)。在注射高剂量TGF-β受体拮抗剂LY2109761(10μg)之后,CirbpmRNA表达水平呈现显著逆转,与热激组相比,表达水平明显上调(p=0.038),与对照组相比无统计学差异。GC2-spd细胞在热激后48小时,Cirbp基因表达水平与对照组相比也显著降低(p<0.01)。在细胞培养基中加入TGF-β1之后,Cirbp表达水平虽呈现轻微的下降趋势,但差异无统计学意义(p=0.09),加入TGF-β2及TGF-β3之后,Cirbp mRNA表达均显著下调(p值均小于0.01)。当在培养基中同时加入TGF-β1,TGF-β2及TGF-β3之后,Cirbp mRNA表达水平降低最明显,但与单纯加入TGF-β2及TGF-β3相比,并无统计学差异(p值均大于0.05)。结论:睾丸局部热激后,TGF-β的表达上调,以TGF-β2和TGF-β3的上调更为明显。TGF-β2及TGF-β3对精母细胞CIRBP的表达具有负向调控作用,热激引起的Cirbp表达下调可能是通过上调TGF-β介导的。第四部分CIRBP表达下调对精母细胞增殖和凋亡的影响目的:探究CIRBP表达下调对精母细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计Cirbp基因的siRNA,对小鼠精母细胞(GC2-spd)进行体外转染,以构建GC2-spd Cirbp基因低表达模型。运用CCK8细胞增殖检测方法检测细胞转染48小时后GC2-spd细胞增殖活性,并运用Annexin-V和Pyridine iodide(PI)双染细胞在流式细胞仪上进行凋亡水平检测。结果:共设计3对Cirbp基因干扰序列及一对阴性对照序列,转染GC2-spd细胞48小时后运用RT-PCR及Western blot检测发现siCirbp-277的干扰效率最高,达到54.5%。运用siCirbp-277转染GC2-spd细胞后,细胞的增殖活性显著低于正常对照组(p<0.001)及阴性对照转染组(p=0.001)。siCirbp-277组转染48小时后细胞凋亡比例均值达到11.7%,显著高于正常对照组(2.5%,p=0.001)及阴性对照转染组(3.1%,p=0.001)。结论:CIRBP表达下调明显抑制了GC2-spd细胞的增殖活性,并诱导了GC2-spd细胞的凋亡,这可能在热激所致的生精细胞凋亡中发挥了关键的作用。