论文部分内容阅读
目的:研究芍药苷(PAE)对小鼠日本血吸虫病肝纤维化IL-13及IL-13-STAT6信号转导通路的影响。方法:用血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,小鼠被随机分成3组,分别为正常组、模型组和治疗组。在感染后12天,治疗组小鼠给予30mg/kg/day PAE灌胃治疗,连续30天,为了降低小鼠死亡率,在42天给予小鼠吡喹酮杀虫治疗,感染后102天,处死各组小鼠,用4%多聚甲醛固定肝组织, HE和Masson染色了解PAE对肝肉芽肿、肝纤维化的影响,免疫组织化学(Immunohistochemistry)检测PAE对α-SMA和Col?表达的影响;其余肝组织匀浆用以检测PAE对羟脯氨酸、胶原?、胶原Ш、IL-13、IL-13Rα2的影响;用原位灌流-密度梯度离心法提取正常健康小鼠肝星状细胞(HSCs),经50ng/ml rIL-13刺激HSCs后,再以不同浓度PAE加以刺激,分别用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法、反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)以及酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)观察PAE对rIL-13刺激的HSCs增殖和分泌胶原的影响。最后,用RT-PCR和Western- blotting分析PAE是否对rIL-13刺激的HSCs中的IL-13受体以及JAK-STAT6通路中相关信号分子STAT6、p-STAT6以及SOCS-1表达有影响。结果:1.早期给予PAE可减轻血吸虫病小鼠肝肉芽肿和肝纤维化的形成。感染血吸虫尾蚴后第12 d(在杀虫治疗前第30 d)开始给予PAE(30mg/kg/day)连续灌胃30天,在第102天处死小鼠后,分别检测:1) PAE对小鼠肝脏组织学的影响:肝组织的HE和Masson染色结果显示,PAE能显著降低小鼠血吸虫并肝肉芽肿大小和肝纤维化程度,且和模型组相比较,肝肉芽肿大小减小达53.4%,肝纤维化评分降低达38.5%。2)免疫组织化学结果提示:PAE治疗组小鼠肝脏α-SMA、Col I表达较模型组分别降低了30.3%和46.6%;3)肝组织匀浆羟脯氨酸碱消化比色法检测显示:PAE明显降低治疗组小鼠肝组织的羟脯氨酸含量,并较模型组小鼠Hyp含量降低达54.7%;4)肝组织匀浆ELISA检测显示:PAE治疗组小鼠肝组织的Col I和ColШ在肝组织中的表达明显降低。以上结果提示早期给予PAE能改善慢性血吸虫性肝肉芽肿和肝纤维化的形成。2. PAE对小鼠肝脏IL-13和IL-13Rα2的浓度的影响肝组织匀浆ELISA检测显示PAE治疗组小鼠肝组织的IL-13和IL-13Rα2含量与模型组小鼠相比较,前者明显降低,而后者却显著升高,提示IL-13表达的降低以及IL-13Rα2的表达增强可能与日本血吸虫性肝肉芽肿和肝纤维化的改善有关。3. rIL-13刺激HSC受体成分的分析RT-PCR显示,rIL-13刺激HSCs后,引起其异二聚体受体IL-13Rα1/IL-4Rα的转录而并不引起另一诱饵受体IL-13Rα2的转录,同时不同浓度PAE对IL-13Rα1/IL-4Rα的转录均无任何影响,这提示rIL-13刺激HSC所致的胶原蛋白表达可能是通过IL-13Rα1/IL-4Rα信号转导通路发挥作用。4. PAE对rIL-13刺激HSC增值的影响MTT法显示,50ng/ml的rIL-13可诱导HSCs的增殖,而PAE(15、30、60、120 mg/L)能浓度依赖性地抑制HSCs增殖。这一结果提示,PAE抑制rIL-13所致的HSCs增值可能是其Col?蛋白分泌和合成减少的机制之一。5. PAE抑制rIL-13刺激HSCs胶原蛋白的分泌及合成ELISA、RT-PCR和Western blotting法显示,rIL-13可诱导HSC合成及分泌胶原蛋白I, PAE不仅浓度依赖性地抑制HSCs Col I的分泌,且浓度依赖性地抑制IL-13刺激HSC的Col I转录、合成。6. PAE明显抑制rIL-13刺激的STAT6磷酸化的形成Western blotting显示, rIL-13刺激HSCs后,STAT6的活化在2小时达到最强,4小时后明显减弱;而PAE浓度依赖性的抑制STAT6的活化,同时JAK的抑制剂AG490亦能抑制STAT6的活化。这一结果提示,PAE抑制胶原蛋白的合成可能是抑制STAT6的活化所致,而PAE除了可能直接抑制STAT6活化外,另外可能是通过抑制其上游JAK的活化而导致下游的STAT6活化减少;STAT6活化的抑制导致其下游目的蛋白-胶原蛋白?的合成和分泌减少。7. PAE增强HSCs中SOCS-1的表达RT-PCR和Western blotting显示,rIL-13能诱导HSCs转录和合成SOCS-1,且在rIL-13刺激后1小时SOCS-1的表达达到峰值,随着时间的延长,SOCS-1的表达量下降;而PAE浓度依赖性的增强SOCS-1的表达。这一结果提示,PAE的增强JAK和STAT6负性调控子SOCS-1表达可能是HSCs胶原蛋白?合成和分泌减少的机制之一。结论:1.早期给予PAE可减轻小鼠日本血吸虫病肝肉芽肿、肝纤维化的程度。2. IL-13表达降低、IL-13Rα2的表达增强可能是PAE减轻小鼠日本血吸虫病肝肉芽肿、肝纤维化程度的机制之一。3. PAE抑制rIL-13所刺激的HSC的增殖,可能是PAE抑制rIL-13所致HSCs分泌和合成胶原蛋白?的机制之一。4. rIL-13体外可刺激HSCs表达IL-13Rα1/IL-4R异二聚体受体,而IL-13另一诱骗受体(decoy receptor)IL-13Rα2并不转录,PAE亦不影响这两种受体的表达,提示IL-13可能是通过IL-13Rα1/IL-4R异二聚体受体促进胶原蛋白的合成。5. rIL-13能刺激STAT6的活化,PAE浓度依赖性抑制STAT6的活化,同时JAK抑制剂AG490也能抑制STAT6的活化,提示PAE的作用机制之一可能通过直接抑制STAT6活化或者同时抑制JAK进而导致STAT6的磷酸化降低。静息状态的HSC并不表达STAT6的负性调控蛋白SOCS-1,rIL-13诱导HSC表达SOCS-1,PAE则增强SOCS-1蛋白的表达,提示PAE增强SOCS-1蛋白的表达是导致STAT6磷酸化降低的因素之一。总之,PAE抑制rIL-13刺激HSC胶原产物是通过抑制HSC增值,下调STAT6的磷酸化所致。PAE以上研究结果将为PAE开发成治疗血吸虫病肝纤维化中药提供了实验依据。