论文部分内容阅读
目的:通过对HT22细胞进行氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）建立缺血性卒中体外模型,探究M2表型小胶质细胞来源的外泌体（M2 microgliaderived exosomes,M2-EXO）对OGD后HT22细胞的影响,并利用生物信息学方法预测M2-EXO在缺血性卒中后发挥神经保护作用的分子机制,为缺血性卒中的基础研究及神经保护药物的开发提供数据参考。方法:1.对HT22细胞OGD 1、2、3和6h,CCK-8检测细胞活力,筛选适宜造模时间。白介素-4（interleukin 4,IL-4）干预BV2细胞24h,Western Blot检测M2表型标志物CD206和Arg-1的表达情况。提取并鉴定BV2细胞来源的外泌体,用PKH26标记外泌体膜,荧光显微镜下观察HT22细胞对BV2细胞来源外泌体的摄取情况。CCK-8法评估不同体积（1μL、5μL和10μL）M2表型BV2细胞来源的外泌体干预前后OGD HT22细胞活力,筛选外泌体作用浓度。LDH和NO试剂盒测定外泌体干预前后HT22细胞上清中LDH和NO的表达水平,Western Blot测定外泌体对OGD后HT22细胞中Bax和Bcl-2表达水平的影响。2.IL-4干预原代小胶质细胞12h和24h,免疫荧光技术鉴定CD206的表达情况,Western Blot测定M2表型标志物CD206和Arg-1的表达。收集M2表型原代小胶质细胞条件培养基（M2 primary microglia conditioned medium,M2-CM）,Western Blot检测M2-CM干预前后OGD HT22细胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。3.通过检索数据库和文献获取M2-EXO或M2-CM中上调的差异表达mi RNA,并预测mi RNA靶基因;通过数据库检索并利用在线工具分析大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/re-perfusion,MCAO/R）后小鼠脑组织差异表达基因（differentially expressed gene,DEGs）,将mi RNA靶基因与MCAO/R后上调的DEGs取交集;对交集基因进行GO功能注释和KEGG通路分析,并构建交集基因的蛋白质相互作用（protein-protein Interaction,PPI）网络;将PPI网络进行可视化,并筛选关键基因;构建mi RNA-m RNA调控网络。结果:1.HT22细胞OGD 2、3和6h均可降低细胞活力,选取3h为适宜造模时间（P＜0.0001）。IL-4干预24h后BV2细胞中CD206（P＜0.05）和Arg-1（P＜0.01）表达上调。成功提取M0和M2表型BV2细胞来源的外泌体,并观察到外泌体均可被HT22细胞摄取。M2表型BV2细胞来源的外泌体（5μL和10μL）处理显著提高OGD后HT22细胞活力,10μL M2表型BV2细胞来源的外泌体（0.11μg/μL）干预效果最佳（P＜0.0001）。OGD后HT22细胞上清中LDH（P＜0.01）和NO（P＜0.01）表达水平显著增加,M2表型BV2细胞来源的外泌体（0.11μg/μL）干预逆转了上述效应（P＜0.05）。Western Blot结果表明,M2表型BV2细胞来源的外泌体干预可下调OGD后HT22细胞中Bax表达（P＜0.05）,上调Bcl-2表达（P＜0.01）,减轻神经细胞凋亡。2.免疫荧光鉴定结果表明IL-4干预12h后原代小胶质细胞中CD206表达水平升高（P＜0.01）,Western Blot结果进一步显示IL-4干预12h后CD206（P＜0.05）和Arg-1（P＜0.001）表达升高,成功诱导了M2表型原代小胶质细胞。M2-CM处理下调了OGD后HT22细胞中Bax表达（P＜0.05）,上调了Bcl-2的表达（P＜0.01）。3.通过Pub Med和Web of Science检索到6篇符合纳入标准的文献,获取了在M2-EXO中差异表达并进行验证的9个上调的mi RNA,将mi RNA靶基因与小鼠MCAO/R后上调的DEGs取交集,有153个交集基因。GO功能注释和KEGG通路分析结果预测这些基因可在细胞凋亡过程以及PI3K-AKT信号通路中富集。通过构建交集基因的PPI网络筛选出14个关键基因,有8个基因可通过调节PI3K-AKT信号通路参与细胞凋亡过程,分别为Itgav、Itga5、Itga6、Spp1、Col1a1、Col1a2、Col4a1和Lamc1。mi RNA-m RNA调控网络显示这8个基因被mi R-124、mi R-186、mi R-137、mi R-218和mi R-26a-5p调控。结论:M2表型BV2细胞来源的外泌体可增加OGD后HT22细胞活力,降低细胞上清中LDH和NO水平,并通过调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达,减少神经细胞凋亡。通过原代小胶质细胞进一步验证M2-CM可下调OGD后HT22细胞Bax表达,上调Bcl-2表达,减轻细胞凋亡。生物信息学分析结果预测M2表型小胶质细胞可能是通过外泌体中mi R-124、mi R-186、mi R-137、mi R-218和mi R-26a-5p调控靶基因表达,进而影响PI3K-AKT信号通路,减轻神经细胞凋亡,为后续进一步的研究提供参考。