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目的探讨透骨消痛胶囊含药血清影响软骨细胞活性与线粒体凋亡通路及细胞外基质的作用机制。方法1.清洁级4周龄SD大鼠50只,抽签法随机分为5组,即：空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组,每组各10只。分别给予相对应的给药量灌胃3d,腹主动脉采血,制备透骨消痛胶囊含药血清。2.清洁级4周龄SD大鼠20只,取膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞,MTT法绘制软骨细胞生长曲线,选取理想的种子细胞。第3代软骨细胞同步化,分别加入含10%空白组、实验2组的血清DMEM培养24h、48h、72h、96h,MTT法检测软骨细胞活性,确定含药血清的有效干预时间；第3代软骨细胞同步化,分别加入含5%、10%、15%、20%的空白组、实验2组的血清DMEM培养72h,MTT法检测软骨细胞活性,确定含药血清的有效干预浓度。3.第3代软骨细胞培养72h,抽签法随机分为凋亡1组、凋亡2组、凋亡3组、凋亡4组,干预24 h,荧光倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构,Hocehst33342染色检测软骨细胞的凋亡率,确定SNP诱导软骨细胞凋亡的量效关系。第3代软骨细胞培养72h,分别加入含SNP终浓度为1mmol/L 10%空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组的血清DMEM干预24h,MTT法检测软骨细胞活性,Real time RT-PCR检测软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 mRNA基因表达。4.第3代软骨细胞同步化,分别加入含10%空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组的血清DMEM干预72h,MTT法观察软骨细胞的增殖；免疫组化染色分析软骨细胞基质中Ⅱ型胶原的表达,Real time RT-PCR检测软骨细胞基质中CollagenⅡ、PG、Aggrecan、Cathepsin K mRNA基因表达。结果1.原代、第2代、第3代软骨细胞生长状况良好,甲苯胺蓝染色,胞浆内见紫红色异染颗粒,Ⅱ型胶原免疫组化染色,胞浆被染成棕黄色,胞核不着色；至第4代,软骨细胞发生梭形变,软骨细胞特有表型开始丢失。增殖曲线上,第2、3代软骨细胞生长旺盛,活性比第4、5代软骨细胞高,尤其是第3代软骨细胞。2.透骨消痛胶囊含药血清干预后,软骨细胞0D值,干预72h明显高于干预24h、48h、96h(P<0.05)；10%含药血清浓度组明显高于5%、20%含药血清浓度组(P<0.01)。确定72h为有效作用时间,10%为有效作用浓度。3.干预24h, SNP诱导软骨细胞凋亡的有效作用浓度为1mmol/L;含药血清干预24h,软骨细胞0D值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞Bcl-2mRNA表达,对照组、实验组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞Bax、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达,对照组、实验组明显低于空白组(P<0.01)。4.在10%含药血清浓度的作用下干预72h,第3代软骨细胞0D值,透骨消痛胶囊实验组明显高于空白组(P<0.01),实验2组增殖效果最明显(P<0.05)；Ⅱ型胶原免疫组化染色,透骨消痛胶囊实验组Ⅱ型胶原表达强于空白组及对照组；CollagenⅡ、PG、Aggrecan mRNA基因表达,透骨消痛胶囊实验组明显升高(P<0.01),其中实验2组升高最显著(P<0.01)；Cathepsin K mRNA基因表达,透骨消痛胶囊实验组明显降低(P<0.01),其中实验2组降低最显著(P<0.01)。结论1.透骨消痛胶囊含药血清干预软骨细胞活性的有效作用时间为72h,有效作用浓度为10%。2.透骨消痛胶囊含药血清能加速软骨细胞增殖,维持软骨细胞活性,其促进软骨细胞增殖与药物浓度有关,以中剂量药物浓度(含透骨消痛胶囊29mg/d)为最佳。3.透骨消痛胶囊含药血清能下调软骨细胞促凋亡基因Bax、Caspase-9、Caspase-3表达,上调抗凋亡基因Bcl-2表达,抑制软骨细胞线粒体凋亡通路的信号转导。4.透骨消痛胶囊含药血清能上调软骨细胞基质中CollagenⅡ、PG、Aggrecan mRNA基因表达,下调Cathepsin K mRNA基因表达,促进细胞外基质的合成,调控细胞外基质和软骨细胞之间的动态平衡,而且以中剂量药物浓度(含透骨消痛胶囊29mg/d)的调控作用最为显著。