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断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PWMS)是由猪2型圆环病毒(Porcine circovirus serotype 2,PCV2)引起的一种新发现的传染病,它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡,还与仔猪A2型先天性震颤(Congenital tremor type A II,CT)、怀孕母猪繁殖障碍(Reproductive failure)、成年猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy,PDNS)和呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease syndrome, PRDS)有关。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展,给许多国家和地区带来巨大的损失。更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,造成的间接损失难以估计。目前,PCV2已经成为严重阻碍我国养猪业发展的主要病原之一。为了调查确证陕西省是否受到该病的感染,为我国诊断、防制与研究该病提供科学依据与技术手段,笔者进行了陕西省断奶仔猪多系统衰竭综合征的研究,取得以下结果:1.陕西省PMWS感染的血清学调查。通过对陕西省多个不同地区的规模化养猪场的PCV2抗体进行检测,结果表明:陕西省该病的平均阳性率为32.9%(78/237);无PMWS症状的断奶仔猪阳性率为28.6%(2/7),疑患PMWS的阳性率为61.5%(8/13);肥育猪阳性率为43.7%(31/71),种公猪阳性率为16.7%(2/13),后备母猪阳性率为15.6%(7/45);经产母猪阳性率为60.4%(29/48);不同地区PCV2感染的程度具有一定的差异,阳性率从20%到65%不等。首次从血清学方面确证陕西省养猪业已经受到PCV2的感染。2.PCV2 SX株的分离与鉴定。根据GenBank中猪圆环病毒1型和2型的序列,设计2对套式PCR引物,从160头疑死于PMWS的仔猪组织病料提取DNA,进行套式PCR扩增,检测到了87份PCV2阳性病料。取其中3份病料接种PK-15细胞传代培养,提取第10代和20代细胞培养物中的DNA做PCR与简介免疫荧光鉴定,获得了PCV2陕西分离株。首次从病原学方面证明PCV2已经在陕西省广泛流行。3.PCV2 ORF2基因的克隆及其序列分析。根据GenBank中PCV2 ORF2基因序列设计1对引物,在引物P1中引入Kpn I酶切位点,引物P2中引入HindⅢ酶切位点。从PCV2陕西分离株细胞培养物中扩增ORF2基因(702 bp),并克隆入pMD18-T载体,经PCR、酶切、测序鉴定,筛选出重组质粒pMD-ORF2。对测序结果用DNAStar软件分析并与GenBank上发表的其他序列进行比对,绘制遗传进化树。结果表明,所克隆的ORF2基因与DB分离株核苷酸序列同源性最高,为99.7%,与其它PCV2的ORF2核苷酸序列同源性在90.6%～99.7%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.9%～99.6%之间。说明PCV2陕西分离株未发生明显的变异。4.PCV2抗体检测间接ELISA方法的建立。根据GenBank中PCV2 ORF2基因序列设计1对引物,应用PCR扩增PCV2 ORF2基因的3’端约600 bp。该PCV-2 ORF2基因已去除终止子,并在其上下游添加Kpn I和Hind III酶切位点。PCR产物用Kpn I和Hind III酶切后与经同样处理过的pBAD/gIIIB Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示一条约28 ku的目的条带,纯度达到85%以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。用该方法对陕西关中和陕北10个养猪场的160份血清进行了检测,其结果与用华中农业大学猪2型圆环病毒ELISA检测试剂盒检测的结果一致。5.PCV2 ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达。将重组质粒pMD-ORF2和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用Kpn I和HindⅢ双酶切,经酶切的ORF2基因和穿梭载体pAdTrack-CMV连接后转化E.coli DH5α,酶切、测序鉴定。将获得携有PCV2 ORF2基因的重组穿梭载体线性化后与腺病毒基因组骨架载体pAdEasy-1共转染E.coli BJ5183,使之同源重组。经PCR、酶切鉴定后获得重组的腺病毒质粒,最后用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染入293细胞,获得含PCV2 ORF2基因的重组腺病毒。经Western blot证明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性,为PCV2感染的诊断和PCV2疫苗的研制奠定了基础。6.PCV2重组腺病毒对小鼠的免疫试验。将72只6周龄小鼠随机分成3组,分别皮下接种AdCMV—ORF2(107TCID50/只)、不含ORF2基因的腺病毒空载体(107TCID50/只)和PBS液。2周后重复免疫。在第2次接种前和接种后2、4、6周,用间接ELISA法测定血清中抗PCV2 ORF2蛋白的抗体水平。结果显示,在第2组和第3组小鼠的血清中未检测到抗PCV2抗体,但在用AdCMV—ORF2接种的第1组小鼠对PCV2 ORF2蛋白产生了较好的体液免疫反应。第1次免疫后2周(第2次免疫前),第1组所有的小鼠血清抗体转为阳性,且抗体水平达到1:800以上。第2次免疫后2、4、6周,其抗体水平分别达到1:1800、1:4800和1:3600。研究结果为进一步研制猪圆环病毒重组腺病毒活载体疫苗奠定了良好的基础。