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目的:肥大细胞类胰蛋白酶已被证明在皮肤、肺成纤维细胞和肝星型细胞增生和胶原合成中具有重要作用。本实验研究肥大细胞类胰蛋白酶(tryptase)及蛋白水解酶抑制剂苯甲脒(benzamidine hydrochloride hydrate,BZ)对人肾成纤维细胞的影响,以探讨肥大细胞类胰蛋白酶在肾纤维化过程中的作用。方法:收集因肾肿瘤作肾切除术的人肾标本,取远离肿瘤部位的肾组织(经光镜检查,无肿瘤细胞),分离、培养人肾间质成纤维细胞。应用细胞形态学、免疫细胞化学和电镜鉴定培养的细胞为人肾成纤维细胞后,分为以下各实验组:1. 各浓度类胰蛋白酶加等量肝素(wt/wt):(1)0ng/ml类胰蛋白酶+0ng/ml肝素(2)10ng/ml类胰蛋白酶+10ng/ml肝素(3)100ng/ml类胰蛋白酶+100ng/ml肝素(4)500ng/ml类胰蛋白酶+500ng/ml肝素2. 不加肝素的各浓度类胰蛋白酶:(1)0ng/ml类胰蛋白酶(2)10ng/ml类胰蛋白酶(3)100ng/ml类胰蛋白酶(4)500ng/ml类胰蛋白酶3.各浓度肝素单独作用:(1)0ng/ml肝素(2)10ng/ml肝素(3)100ng/ml肝素(4)500ng/ml肝素4.200umol/L蛋白水解酶抑制剂苯甲脒(benzamidine hydrochloride hydrate,BZ)处理组:(1)10ng/ml类胰蛋白酶+10ng/ml肝素+200umol/L BZ(2)100ng/ml类胰蛋白酶+100ng/ml肝素+200umol/L BZ <WP=9>(3)500ng/ml类胰蛋白酶+500ng/ml肝素+200umol/L BZ5.10ug/ml TGF-β抗体处理组:(1)10ng/ml类胰蛋白酶+10ng/ml肝素+10ug/ml TGF-β抗体(2)100ng/ml类胰蛋白酶+100ng/ml肝素+10ug/mlTGF-β抗体(3)500ng/ml类胰蛋白酶+500ng/ml肝素+10ug/mlTGF-β抗体各组细胞培养48h后,检测人肾成纤维细胞的增生状态,I型胶原、蛋白水解酶激活受体2(protease activated receptor-2, PAR2)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP1)以及α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。成纤维细胞的增生状态采用四甲基偶氮唑盐(Methylthio tetrazole, MTT)比色法检测。I型胶原、PAR2、MCP1mRNA的表达采用半定量反转录-多聚酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测。α-SMA蛋白表达采用免疫细胞化学方法检测。 结果:1. 原代培养的人肾组织细胞,在倒置显微镜下呈梭型生长;免疫细胞化学染色显示所培养细胞波形蛋白(vimentin)和α-SMA阳性,角蛋白(keratin)和CD34阴性;电镜下可见细胞内有大量微丝、高尔基复合体和粗面内质网,证明我们所培养的细胞是人肾成纤维细胞;2. 类胰蛋白酶在10～500ng/ml范围内,以剂量依赖方式促进人肾成纤维细胞增生,最高达对照组的3.07倍。在200umol/L苯甲脒作用下,类胰蛋白酶的促培养细胞增生效应被抑制,最高可抑制81%;3. 半定量RT-PCR法扩增PAR2、I型胶原和MCP1mRNA(324bp、332bp、257bp)结果表明:在等量肝素存在条件下,类胰蛋白酶在10～500ng/ml范围内,以剂量依赖方式促进培养的人肾成纤维细胞表达I型胶原、PAR2和MCP1,最高分别达对照组的3.14、3.71、4.98倍。200umol/L苯甲脒能抑制类胰蛋白酶对培养的人成纤维细胞表达I型胶原、PAR2和MCP1的促进作用,抑制率为53%～84%。结论:1.本实验成功培养了人肾成纤维细胞。2. 在肝素的协同作用下,类胰蛋白酶能刺激体外培养的人肾成纤维细胞增生、活化,表达PAR2和MCP1等致炎致纤维化因子,表达肾间质ECM的重要成分I型胶原,提示肥大细胞分泌的类胰蛋白酶是重要的致炎致纤维化因子,可能参与了慢性肾脏病时肾组织纤维化的发生和发展。 <WP=10>3.类胰蛋白酶不是通过TGF-β途径,而很可能是通过PAR2途径,发挥其促进人肾成纤维细胞增生与活化。4.蛋白水解酶抑制剂苯甲脒能抑制类胰蛋白酶对人肾成纤维细胞增生和I型胶原、PAR2 及MCP1表达的诱导促进作用,提示蛋白水解酶抑制剂有抑制肾组织纤维化的作用。