葱蝇HSP23基因的克隆及在滞育时期的表达

来源 :重庆师范大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:zyf20011027
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滞育是昆虫及其近缘节肢动物在特定发育期发育停滞、不食不动、新陈代谢降低的一个生理现象。昆虫滞育不仅仅关闭一系列基因的表达,还启动一套新基因的表达,是一个独特的发育和生理过程。昆虫滞育的行为及其生理变化也与特定的基因表达相关。因此,研究昆虫滞育基因的表达对深入理解昆虫滞育及其调控的分子机理有着重要的作用。已报道的与昆虫滞育有关的基因主要是热激蛋白(heat-shockproteins,HSP):sHSP、HSP60、HSP70和HSP90。
  对sHSP的研究,已经深入到它在生物体内作为分子伴侣、诱导生物体耐热性和稳定细胞骨架等生物学功能水平上。但sHSP仅在秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、小鼠(Musmusculus)和人类等几个物种中研究得较多。对红尾肉蝇(Sarcophaga.crassipalpis)的小热激蛋白基因HSP23的研究发现,在正常滞育期HSP23基因是抬高表达的,对红尾肉蝇的越冬起着重要作用;但在丝光绿蝇(Luciliasericata)滞育时期,HSP23基因却并不抬高表达。这说明HSP23基因并不一定在昆虫滞育期间都抬高表达。但要充分说明HSP23基因在昆虫滞育期的表达情况,则需要研究更多的不同滞育类型的昆虫。
  葱蝇(Deliaantiqua)是研究滞育的理想物种,它的滞育(包括冬滞育和夏滞育)生物学特性已研究清楚,并可在实验室进行大规模饲养,在系统发育上与黑腹果蝇近缘。本研究采用RACE-PCR的方法克隆了葱蝇HSP23基因(DaHSP23),并对该基因进行系统进化分析,该基因序列和氨基酸序列都登录到GenBank,登录号分别为HQ392521.1和ADX36150。同时采用实时荧光定量PCR研究了DaHSP23基因在葱蝇滞育时期的表达情况。研究结果如下:
  ①葱蝇HSP23基因的克隆和序列分析
  克隆了葱蝇HSP23基因的cDNA序列,其cDNA全长序列为904bp,开放阅读框为561bp(133~693),共编码186个氨基酸,推测蛋白分子量为20.9kDa,等电点为6.42。同时,从基因组DNA水平上,鉴定了该基因不含有内含子。进行多序列分析发现,该基因与其它双翅目昆虫的sHSP有超过64%的相似度。对葱蝇HSP23结构和功能位点的预测表明:它含有α-crystallin保守结构域(这是典型的sHSP基因家族特征),位于第65~142个氨基酸序列之间;还含有InpA区域(与蛋白质翻译后的修饰,折叠和分子伴侣有关的区域),位于第12~158个氨基酸序列之间。
  ②葱蝇滞育的诱导
  葱蝇成虫饲养在温度23±1.0℃、光周期16L:8D和相对湿度50~70%的条件下。葱蝇非滞育、冬滞育和夏滞育的诱导和结束条件分别为:非滞育幼虫和蛹饲养在温度20±0.2℃、光周期16L:8D和相对湿度50~70%的条件下,其幼虫和蛹都生长良好;冬滞育诱导条件是将幼虫和蛹置于15±0.5℃、光周期12L:12D和相对湿度50~70%的条件下诱导,几乎100%的蛹都能被诱导进入冬滞育;夏滞育诱导条件是将幼虫和蛹置于25±0.5℃、光周期16L:8D和相对湿度50~70%的条件下,至少95%的蛹进入夏滞育,适当提高光照强度,则可以将诱导率提高至100%,结束夏滞育最佳温度为16℃。
  葱蝇滞育时期取样点的选择,分别为:非滞育取样点是在非滞育化蛹后的第1、3、5、7、9、11和13天,共7个取样点;冬滞育取样点是在冬滞育化蛹后的第3、4、29、54、79、103和114天,共7个取样点;夏滞育取样点是在夏滞育化蛹后的第0.5、1、5、9、10、11和17天,共7个取样点。
  ③葱蝇HSP23基因在滞育期的表达
  应用荧光定量PCR方法研究了葱蝇不同滞育时期的蛹中HSP23基因的相对表达量,结果表明:葱蝇HSP23基因的mRNA在冬滞育和夏滞育时期都是抬高表达,在冬滞育和夏滞育后期时,其表达量降低。这些结果说明了葱蝇HSP23基因在滞育时期抬高表达,可能对葱蝇成功越冬或者避暑起着重要作用。
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