肿瘤坏死因子-α是一种具有多种生物学活性的多效性细胞因子,来源极广泛,主要包括脂肪细胞、激活的小胶质细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞。有活性的TNF-α分子量为17KD,以三聚体形式与细胞表面的TNF受体(TNFR)结合,介导多种生物学活性。已知TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子,但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡,与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。在许多疾病,如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合征(MDS)等的病理生理过程中TNF-α起着重要的介质作用。临床上,抗TNF-α的治疗性抗体被成功用于治疗RA、Crohn’s病,同时研究表明其对牛皮癣和强直性脊髓炎也具有肯定的疗效。目前已有2种抗TNF-α的抗体被FDA批准用于治疗RA——Infliximab(Remicade)和Adalimumab(Humira)。另外,目前临床在研的多株抗TNF-α的中和抗体也取得良好的效果。人源性抗体在治疗中独具优势,被认为是治疗性抗体发展的最终方向。Humira作为第一个上市的全人源抗体,2008年年销售额就超过30亿美元。我国类风湿性患者众多,在我国研制具有自主知识产权的TNF-α人源性中和抗体具有重要的应用价值。本研究以原核表达的hTNF-α为抗原,利用本室构建的大容量全合成人源性抗体库进行筛选,获得两株特异性较好并且有一定细胞学活性的hTNF-α人源性中和抗体,为相关疾病的治疗研究奠定良好的基础。首先,原核系统表达纯化hTNF-α。表达质粒pBVTNF在大肠杆菌DH5α中经过42℃热诱导6小时后获得了hTNF-α可溶性表达,接着根据其理化性质即等电点PI5.6、分子量大小17KD、以及疏水性质采用离子交换、疏水层析、凝胶过滤三种方案对其进行了纯化并获得纯品。以获得的表达纯化的TNF-α作为抗原,对库容量为1.35×1010的大容量人源噬菌体单链抗体库进行了特异性抗体的筛选。三轮筛选后采用ELISA方法进行特异性抗体的鉴定,得到3株具有不同序列的单链抗体W18、G3-4、T12,并利用pel-SN表达载体实现了3株单链抗体在大肠杆菌中的分泌表达。pel-SN表达载体是本室在大肠杆菌可溶性表达载体PTIG-Trx的基础上进行改造后所得到的大肠杆菌分泌型表达载体,在原载体的基础上引入了pelB信号肽序列,并且引入了SfiI和NotI酶切位点,以方便从含单链抗体基因的噬菌体质粒直接克隆到分泌型表达载体中。对三株抗体分泌表达产物进行特异性鉴定,W18保持了与噬菌体抗体相同的结合特异性,但T12丧失了与抗原结合的活性,G3-4改造为单链抗体后的结合特异性降低。蛋白质通过特定的三维空间结构发挥其特殊生物活性。蛋白质的三维结构信息对于了解蛋白质的折叠机理、酶催化活性、分子稳定性、蛋白质结构域之间的相互作用以及蛋白质分子与配基的相互作用等方面都是至关重要的。另外蛋白质的三维结构信息也是分子设计研究、生命进化规律研究以及药物设计的基础,因此蛋白质三维结构的研究非常重要。同源模建方法是蛋白质结构预测方法中应用得最多也是最成熟的方法,在蛋白质工程研究中已有广泛应用。同源模建方法的理论基础就是一级序列决定三维结构,序列同源性高的蛋白质其三维结构也应该相似。T11是本室从大容量抗体库中筛选出来的一株抗TNF-α突变体的特异性噬菌体抗体,该株抗体也能与野生型的TNF-α特异性结合,但转换为IgG型后其特异性下降。本实验中将抗天然TNF-α特异性抗体W18与T11抗体分别进行计算机同源模建,分析TNF-α参与与之相互作用的氨基酸位点以及抗体参与与抗原相互作用的氨基酸。结果显示,TNF-α参与与W18相互作用的关键氨基酸残基为65位、140-157位氨基酸段;而TNF-α参与与T11相互作用时关键氨基酸残基29-33位氨基酸残基、65位氨基酸、140-157位氨基酸位点。另外,分析抗体参与与TNF-α相互作用时,研究结果初步表明可能W18的轻链较T11的轻链在参与抗原抗体反应中作用的原子更多,而T11的重链较W18的重链在参与与抗原抗体反应中作用的原子更多。根据以上实验数据我们将W18的轻链与T11的重链进行了重新组合得到一株新的组合抗体即W1hT11,对其分别在单链和全抗水平进行了特异性分析,结果表明该株抗体的特异性较好。将得到的两株抗体W18、W1hT11改造为全抗体形式,在FreeStyleTM细胞中获得了瞬时表达。W18、W1hT11全抗体保持了与TNF-α特异性结合的活性。采用非竞争酶联吸附实验测定了W1hT11、W18全抗体与抗原的亲和常数KD分别为4.3×10-8M和7.5×10-8M。为了分析W18、W1hT11与抗原的结合表位,根据计算机同源模建的结果设计并构建了4个TNF-α突变体即65位突变为甘氨酸突变体、84-91位缺失突变体、140-157位缺失突变体以及84-91位与140-157位同时缺失突变体,实现了这4个突变体在大肠杆菌DH5α中的表达。利用western-blot检测了W18、W1hT11单克隆抗体与各突变体的结合情况。初步实验结果表明,W1hT11识别的抗原表位可能位于140-157位与84-91位,W18识别的抗原表位可能位于65位与84-91位。利用TNF-α杀伤L929细胞活性实验检测W18、W1hT11的体外中和活性,结果表明,W18、W1hT11均能一定程度上拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用。W1hT11这株抗体在浓度为80ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率达到90.85%,随着其浓度的下降中和率降低,到50ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率为43.94%;W18这株抗体的中和率相对低一些,在浓度为80ug/ml时中和率为79.58%,随着其浓度的降低对TNF-α细胞毒的中和率也呈相应的下降趋势,到50ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率为36.86%。本研究从大容量全合成人噬菌体抗体库中共获得了2株具有体外中和活性的抗肿瘤坏死因子-α的人源单克隆抗体W18、W1hT11,为下一步深入研究研制肿瘤坏死因子-α中和抗体药物奠定了良好的基础。