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第一部分慢性丙型肝炎患者体内RIG-Ⅰ信号通路的研究研究背景丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一种单股正链RNA病毒,主要有6种基因型和超过70种亚型。据世界卫生组织估计全球大约有1.85亿人感染HCV,占世界人口的3.2%,同时每年大约有300到400万新发病例。急性丙型肝炎(Acutehepatitis C,AHC)大多是无症状的,其中55%-85%感染者不能清除该病毒并最终发展为慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC),经过20～30年的时间大约有10%-20%患者发展为肝硬化,1%-7%患者发展为肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。传统的治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林方案,但是抗病毒疗效不佳并且不良反应较大;新型直接抗病毒药物(Direct-acting antiviral agents,DAAs)仍依赖聚乙二醇联合利巴韦林,且具有副作用及未知禁忌症。CHC的治疗及发病机制的研究,仍然是基础医学和临床医学探讨的热点。有研究表明,人感染HCV后,男性较女性更容易发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。这种性别与HCV感染转归差异的机制仍不清楚。目前,越来越多的证据表明,固有免疫在机体清除病毒或抗病毒治疗中起到非常重要的作用,因此,本文将就性别与固有免疫中RIG-Ⅰ及干扰素信号通路的关系进行探讨。研究目的1.了解CHC患者和健康人RIG-Ⅰ与干扰素基因表达量的差异。2.了解不同性别CHC患者体内RIG-Ⅰ与干扰素基因表达量的差异。研究方法1.研究对象:选择2014年7月至2016年7月在武汉大学人民医院感染科就诊CHC患者作为研究对象。所有患者HCV基因型均为1b型,诊断符合《丙型肝炎防治指南》,排除自身免疫系统疾病,其他系统严重疾病及感染性疾病。并选择同期体检健康人作为对照。2.实时荧光定量PCR检测:本研究所用引物利用美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)网站中提供的 RIG-Ⅰ、干扰素mRNA序列和BLAST进行引物设计,采用实时荧光定量PCR检测RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β和 GAPDH mRNA 表达量。3.统计分析:用SPSS 20.0软件对数据进行分析。正态分布的计量资料用均值(标准差)表示,非正态分布的计量资料采用均值(四分位间距)表示,计数资料采用百分数表示。两样本均数间比较采用t检验,多个样本均数间两两比较用SNK检验,计量资料比较采用卡方检验,相关性分析使用Pearson(正态分布)或Spearman法(非正态分布)。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.与健康人相比,CHC患者肝功能指标ALT、AST、ALP、GGT、PA、TP、ALB、GLB、TBIL和DBIL明显异常,且hs-CRP升高,PT-act下降,差异有统计学意义。2.CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量明显低于健康人,差异有统计学意义。3.RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量在男性和女性CHC患者间比较,差异无统计学意义。4.育龄期女性CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β基因表达量明显高于绝经后CHC患者和男性CHC患者;而绝经后女性CHC患者和男性CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β基因表达量比较,差异无统计学意义。5.CHC患者RIG-Ⅰ基因表达量与IFN-β基因表达量成正相关,与IFN-α基因表达量无相关性。研究结论1.CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量明显下降,且RIG-Ⅰ基因可通过调节IFN-β基因表达量发挥抗病毒作用。2.育龄期女性患者IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ基因表达量较高,抗HCV力强于绝经后女性患者和男性患者。第二部分雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞RIG-Ⅰ信号通路的影响研究背景本课题前期研究表明,女性感染HCV后其体内RIG-Ⅰ及干扰素基因与男性相比无明显差异,但育龄期妇女较绝经后妇女和男性患者RIG-Ⅰ及干扰素基因明显升高,差异具有统计学意义。因此本文旨在探讨雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中 RIG-Ⅰ 抗病毒信号通路的影响,为临床寻找新的更有效的CHC治疗方法提供有力证据。研究目的探讨雌激素对慢性丙型肝炎患者PBMC中RIG-Ⅰ及干扰素基因表达量的影响。研究方法1.慢性丙型肝炎患者PBMC提取和培养:选择2014年7月至2016年7月在武汉大学人民医院感染科就诊且未治疗的CHC患者6例,男性和女性患者各3例,诊断符合《丙型肝炎防治指南》。所有患者HCV基因型均为1b型,排除自身免疫系统疾病,其他系统严重疾病及感染性疾病。选择同期体检健康者6名作为对照,男性和女性各3名。采用Ficoll单次密度梯度离心法提取单个核细胞。在37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。2.实时荧光定量PCR检测:利用美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)网站中提供的 RIG-Ⅰ、干扰素 mRNA 序列和BLAST进行引物设计,采用实时荧光定量PCR检测RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β和GAPDH mRNA表达量。3.统计分析:用SPSS20.0软件分析雌激素对不同性别组间RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量的影响。正态分布的计量资料用均值(标准差)表示,两样本均数间比较采用t检验,多个样本均数间两两比较用SNK检验,对服从正态分布的数据相关性分析使用Pearson法,不服从正态分布的数据相关性分析使用Spearman法。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.在健康对照组中,男性PBMC加入干扰素刺激后RIG-Ⅰ基因表达量较未加干扰素刺激对照增加了 3.07倍;而女性PBMC加干扰素刺激后RIG-Ⅰ基因表达量较未加干扰素刺激对照增加了 5.28倍。2.单独用干扰素刺激男性CHC患者和男性健康对照者PBMC后,RIG-Ⅰ基因表达量比较,差异无统计学意义(t=0.82,P =0.45)。而单独用干扰素刺激女性CHC患者和女性健康对照者PBMC后,RIG-Ⅰ基因表达量比较,差异有统计学意义(t=4.34,P=0.01)。3.在男性CHC患者中,单独用干扰素刺激PBMC后RIG-Ⅰ基因表达量明显增加,是未加干扰素刺激对照的2.58倍;干扰素预刺激PBMC后,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较单独干扰素刺激对照显著增加(t=7.56,P<0.001);干扰素预刺激PBMC后,用雌激素拮抗剂ICI182780作用PBMC 4h,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较未加雌激素拮抗剂作用对照显著下降(t=7.35,P<0.001)。4.在女性CHC患者中,具有与男性患者相同的结果。单独用干扰素刺激PBMC后RIG-Ⅰ基因表达量也明显增加,是未加干扰素对照的2.23倍;干扰素预刺激PBMC后,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较单独干扰素刺激对照显著增加(t=8.98,P<0.001);干扰素预刺激PBMC后,用雌激素拮抗剂ICI182780作用PBMC4h,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较未加雌激素拮抗剂作用对照显著下降(t=7.86,P<0.001)。5.单独干扰素,干扰素加雌激素以及干扰素结合雌激素拮抗剂加雌激素,分别刺激CHC患者PBMC发现,IFN-α、IFN-β基因表达量差异无统计学意义(P均>0.05)。研究结论1.干扰素能增加健康人PBMC中RIG-Ⅰ基因表达量。2.干扰素能增加CHC患者PBMC中RIG-Ⅰ基因表达量,女性患者增加更显著。3.雌激素通过协同干扰素增加RIG-Ⅰ基因表达量机体抗病毒能力。4.雌激素对IFN-α、IFN-β基因表达量无影响。