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背景:凋亡是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制,在清除无用的、多余的或癌变的细胞,维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。最早对ProgrammeDCellDecthprotein2(PDCD2)研究发现该蛋白可能参与细胞凋亡。但随着对其研究的深入,发现该蛋白似乎与细胞凋亡无关,但是和细胞的发育,细胞周期以及某些疾病有一定的联系。PDCD2蛋白具有一个重要的功能结构域一PDCD2_C结构域。将带有PDCD2_C结构域的蛋白都归为PDCD2_C蛋白。调查发现PDCD2_C蛋白似乎只存在真核生物细胞中。并且这类蛋白由基因编码,在人和小鼠各个组织都有表达。在裂殖酵母中存在两个PDCD2_C蛋白:SPAC13G6.09,PDCD2的同源蛋白本文中命名为pcd1;SPBC25H2.15,芽殖酵母PDCD2_C蛋白(TSR4)的同源蛋白本文中命名为pcd2。这两个蛋白在裂殖酵母中的功能还未有报道,本文主要探究这两个PDCD2_C蛋白的功能。
实验和结论:1.首先用同源重组和随机孢子分析法,证明了裂殖酵母中pcd1为必需基因,pcd2为非必需基因。这提示这两个PDCD2_C蛋白在裂殖酵母中的功能可能不同。接着用高表达和低表达的pcd1的质粒,都能救活因敲除pcd1致死的单倍体。直接敲除裂殖酵母单倍体pcd2,敲除菌株能正常生长。这两个实验都再次证明pcd1为必需基因,pcd2为非必需基因。
2.用高表达和低表达N端带2个FLAG标签pcd1的质粒都能救活敲除pcd1的单倍体。但是用高表达的人PDCD2、芽殖酵母TSR4、N端为pcd1,C端为人PDCD2蛋白PDCD2_C结构域的融合蛋白、裂殖酵母pcd2和C端带5个FLAG标签pcd1的质粒都不能救活敲除了pcd1的单倍体。这些实验提示:N端2个FLAG标签对pcd1的定位和功能没有太大影响;人和芽殖酵母的PDCD2_C蛋白与裂殖酵母pcd1功能不同,也有可能在裂殖酵母中pcd1还有其他必需功能;人PDCD2_C结构域也不能替代裂殖酵母PDCD2_C结构域,可能因为人PDCD2C结构域替代裂殖酵母的结构域后整个蛋白的空间结构遭到破坏,导致蛋白功能丧失;pcd1和pcd2功能不同;C端的5个FLAG能破坏pcd1的空间结构导致蛋白功能丧失或者5个FLAG阻碍了pcd1与其相互作用蛋白的结合。
3.敲除pcd2的单倍体在面对逆境压力时,生长状态和野生型几乎一致。这表示pcd2在裂殖酵母的应对逆境过程中没有必需的作用。
4.利用酵母双杂交系统中的筛选,与pcd1和pcd2相互作用的蛋白。发现moe1和40S蛋白rps2602片段可能和pcd1相互作用。而SPAC1093.05(ATP-dependentRNAhelicaseHca4)的片段可能与pcd2相互作用。但是验证上述蛋白全长是否和pcd1和pcd2相互作用时,都未能检测出相互作用。利用该系统仍未检测了pcd1和SPAC1002.14(裂殖酵母中泛素化连接酶E3)相互作用。
5.双敲除pcd2和gcn5的单倍体不能存活。但是双敲除pcd2和sty1后单倍体生长和敲除pcd2的单倍体生长状态几乎一致。这提示pcd2和gcn5有可能存在一定的联系,或者共同参与了某种信号传导途径;而sty1可能不是pcd2的磷酸酶。