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目的:应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)对增生性瘢痕成纤维细胞I型胶原蛋白表达的影响。方法:①成纤维细胞体外原代培养:手术取4例增生性瘢痕(hypertrophic scar)(上肢、下肢、腹部、后背各一例),两例来自安徽医科大学第一附属医院整形外科手术病例,两例来自安徽医科大学第一附属医院烧伤科手术病例。按文献方法进行成纤维细胞原代培养,待细胞融合后传代,实验所用细胞均为处于3-5代对数生长期的成纤维细胞。②将不同浓度重组人SPARC(终浓度为2.5、5、10pmol·L-1)对3-5代增生性瘢痕成纤维细胞分别进行干预3h。用Trizol试剂提取成纤维细胞总RNA,核酸测定仪测OD值,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量,逆转录反应获得的cDNA -20℃保存。稀释cDNA成5个梯度(104、103、102、101、100),分别进行靶基因collagen type I及内参基因β-actin的SYBR Green I实时定量PCR反应,制备两组基因的标准曲线并检测扩增效率。③将PCR产物作熔解曲线分析,并进行1%琼脂糖凝胶电泳,确定产物特异性。collagen type I mRNA相对表达量采用Comparative Delta-delta Ct法进行分析。④各组均数之间比较采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析及两两比较的t检验。结果:4例增生性瘢痕标本原代培养成纤维细胞成活良好,传至3-5代用于实验,用不同浓度SPARC作用3h后,终止培养,进入结果分析。①提取的总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳,确定产物特异性,结果显示提取的总RNA质量纯,无明显降解,可以进行下一步的RT-PCR反应。②将逆转录产物经95℃10 s变性,然后95℃5 s, 60℃30 s重复50个循环进行扩增,用Rotor Gene3000系统Comparative Delta-delta Ct法进行分析,结果与空白对照组相比,SPARC2.5pmol·L-1、5pmol·L-1、SPARC10.0pmol·L-1实验组collagen type I mRNA表达量分别增加1.5、3.4、3.9倍。③各组均数之间比较采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析及两两比较的t检验(P<0.05),显示差异具有统计学意义。④将PCR产物作熔解曲线分析,结果显示collagen type I及β-actin基因PCR产物的熔解曲线峰值分别为85℃及89℃,熔解温度均一,为单一锐利主峰,说明无引物二聚体及非特异性扩增,实验结果可靠。结论:重组人SPARC刺激后各实验组相对空白对照组成纤维细胞collagen type I mRNA表达明显增强,提示SPARC在增生性瘢痕中可能具有促进增生性瘢痕成纤维细胞分泌collagen type I的作用,在增生性瘢痕形成过程中可能具有重要作用,为研究增生性瘢痕的形成机制及治疗增生性瘢痕提供新思路。