研究背景及目的:大量研究证实,心脏干细胞（cardiac stem cell,CSC）移植治疗可显著减轻心肌梗死后心室重构,改善心功能,故被认为是目前细胞移植治疗心肌梗死最为理想的干细胞源。然而,心肌梗死后局部微环境恶劣,致使干细胞存活量极少。外泌体（exosomes）作为细胞间信号传导的重要方式,也是细胞存活的微环境的重要组成部分。相关文献报道骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Stem cell,BMSC）来源的外泌体可调控心脏干细胞的增殖、分化及凋亡等过程,而缺氧预处理间充质干细胞可提升其分泌的外泌体抵抗细胞凋亡的能力。此外,众所周知,钙稳态在心肌谱系细胞的信号转导及凋亡中均扮演着弥足轻重的地位,以受磷蛋白（Phospholamban,PLB）等蛋白为主的细胞内质网钙库平衡最关键的内平衡调节系统,调节了细胞内约44%的钙离子。有研究表明,BMSCs源外泌体内富集microRNA-133a,其在心脏谱系细胞中可发挥强大的抗凋亡能力,并可能参与细胞的钙稳态调节过程。本研究前期预实验初步证实,缺氧预处理BMSC-exosome可以抑制氧化应激状态下的C-kit+CSC凋亡,那是否是通过microRNA-133a来发挥作用的呢?是否也是通过作用于以PLB等蛋白为主的内质网钙库系统来调节了其钙稳态进而抑制的凋亡呢?综上所述,本研究旨在探讨缺氧预处理BMSC-exosomes对氧化应激环境中C-kit⁺CSCs抗凋亡作用及其钙稳态调控在其中发挥的重要作用。方法:第一部分1.采用组织块贴壁法培养SD大鼠BMSCs,采用流式细胞技术鉴定其纯度,选取P3-P5代BMSCs备用。以不同浓度的H₂O₂作用于BMSCs不同时间以模拟缺氧预处理环境,采用CCK-8法检测细胞活性,确定促使BMSCs活性达最大值的H₂O₂最佳浓度和时间。2.采用SBI试剂盒法、PEG法、q EV试剂盒法提取骨髓间充质干细胞源外泌体,采用蛋白质印迹法（western blot,WB）检测外泌体表面标记蛋白的表达情况,采用电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）分析所提取外泌体的大小,从平均粒径、蛋白浓度及颗粒拟合浓度等方面对比各方法优劣并选取最优方法提取外泌体。3.采用酶消化法联合磁珠分选法体外分离、培养大鼠C-kit⁺CSCs,采用免疫荧光检测CSCs表面c-kit的表达情况,采用流式细胞术鉴定细胞纯度。同时,以不同浓度的H₂O₂作用c-kit+CSC不同时间以模拟氧化应激环境,选取使c-kit+CSC达到最大凋亡程度的H₂O₂最佳作用浓度和时间。4.采用Di I对所提取的BMSC-exosome进行染色标记,并将之与C-kit⁺CSCs共培养0、1、6、12、24h,观察c-kit+CSC对BMSC-exosome的内化摄取情况,确定最佳共培养时间。5.将BMSC-exosome浓度分为0、100、200、400、800ng/μL组,分别与c-kit+CSC共培养,以cck8法检测其活性,确定使C-kit+CSC达最大活性的BMSC-exosome浓度。6.将实验分为四组:（1）常氧对照组（normal组）:不予以任何处理的CSCs;（2）对照组（control组）:以H₂O₂处理模拟氧化应激状态的CSCs;（3）常氧外泌体组（N-exo组）:与常氧状态BMSC-exosome共培养的氧化应激状态C-kit⁺CSCs组;（4）缺氧外泌体组（H-exo组）:与经缺氧预处理的BMSC-exosome共培养的氧化应激状态下C-kit⁺CSCs组。以Annennexin V-Prodidium iodide（Annexin V-PI）染色,行流式细胞荧光分选技术（Fluorescence activated Cell Sorting,FACS）检测各组细胞凋亡情况;采用WB检测凋亡相关蛋白caspase8、caspase9、cleaved-caspase3的蛋白表达情况;以fluo-8进行染色并采用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙超载情况。第二部分7.为明确H-exo调控氧化应激状态C-kit⁺CSCs钙超载的机制,实验分为三组:（1）normal组（2）control组（3）H-exo组。行WB检测H-exo对内质网钙库调节系统最主要调控蛋白,即心肌肌浆网Ca²⁺-ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase2a,SERCA2a)、受磷蛋白（Phosphoprotein,PLB）、2型兰尼碱受体（Ryanodine Receptor 2,Ry R2）的蛋白表达水平的影响。8.为明确其机制,我们采用RT-PCR检测N-exo及H-exo组内micor RNA-133a m RNA水平表达情况,以明确缺氧预处理对BMSC-exosome中micor RNA-133a表达的影响。9.随后实验分为四组:（1）normal组（2）control组（3）N-exo组（4）H-exo组。以RT-PCR分别检测各组CSCs内micor RNA-133amicroRNA表达情况,以明确BMSC-exosome作用后对C-kit⁺CSCs内micor RNA-133amicroRNA表达的影响。10.以life2000TM为载体将micor RNA-133amicroRNA抑制剂及模拟物及其阴性对照物（50n M）转染至C-kit⁺CSCs,以抑制及过表达氧化应激状态下C-kit⁺CSCs内microRNA-133a的表达。实验分为六组:（1）Control组;（2）H-exo组;（3）转染mimic-micor RNA-133a组（mimic组）:转染micor RNA-133a mimic,随后加入H₂O₂诱导细胞处于氧化应激状态组;（4）转染mimic模拟物的阴性对照组（mimics nagetive control,MNC组）:转染micor RNA-133a mimic的模拟物,随后加入H₂O₂诱导细胞处于氧化应激状态组;（5）作为负性对照的inhibitor组（inbihitor组）:转染micor RNA-133a si RNA作为micor RNA-133a抑制剂,随后加入H₂O₂诱导细胞处于氧化应激状态组;（6）作为负性对照的阴性对照的inhibitor-negative组（INC组）:转染micor RNA-133a si RNA的模拟物作为micor RNA-133a si RNA的阴性对照组,随后加入H₂O₂诱导细胞处于氧化应激状态组。以RT-PCR分别检测各组细胞中micor RNA-133a及PLB m RNA的表达变化;采用WB检测各组细胞中凋亡蛋白caspase8、caspase9和cleaved-caspase3及通路蛋白PLB的表达情况;采用Annexin V-PI染色,行FACS检测各组中细胞凋亡情况;采用fluo-8染色,行激光共聚焦显微镜检测各组中细胞钙离子情况。11.为进一步明确PLB在H-exo调控氧化应激状态下C-kit⁺CSCs钙稳态和凋亡中的作用,我们以life2000TM为载体将PLB抑制剂（si RNA）转入C-kit⁺CSCs中行抑制实验。实验分为4组,即:（1）Control组;（2）H-exo组;（3）转染si RNA的阳性对照组（PLB si RNA组）:转染si RNA-PLB,随后加入H₂O₂诱导细胞处于氧化应激状态组;（4）转染PLB的si RNA模拟物作为阴性对照组（SNC组）:转染si RNA nagetive control,随后加入H₂O₂诱导细胞处于氧化应激状态。行RT-PCR检测各组中PLB m RNA的表达情况;采用WB检测各组中凋亡蛋白caspase8、caspase9和cleaved-caspase3及通路蛋白PLB的表达情况;采用FACS检测各组细胞凋亡情况;采用fluo-8染色,行激光共聚焦显微镜检测各组中细胞钙稳态情况。结果:第一部分1.BMSCs培养48h后部分细胞开始贴壁生长,P3-5代时细胞呈峰谷状或漩涡状生长。FACS结果显示:BMSC表面标记物CD29及CD90分别表达99.7%和96.8%,而白细胞标记物CD45表达仅为1.17%。CCK8结果示,与其余各组相比,以100μmol/L H₂O₂处理2h时,BMSCs活性达到最大值（P<0.05）。2.采用exoquick、q EV、PEG三种方法提取BMSC上清液中的exosome。WB结果显示,三组外泌体CD63蛋白表达均为阳性。电镜示,exosome呈茶托样或杯口样,直径在30-150nm之间。NTA结果示,exoqucik、q EV、PEG所提外泌体峰值分别为:139nm、161nm、163nm。结合外泌体浓度、纯度等相关结果,最终选取exoqucik试剂盒法进行下一步实验。WB结果显示,以细胞碎片为对照,经exoquick提取的外泌体中CD63、CD9、ALIX表达均为阳性。3.原代CSCs贴壁第二天可见部分细胞呈圆形亮点状,第3-5天CSCs逐渐变为长梭形。磁珠分选后行免疫荧光鉴定结果显示,c-kit阳性的CSCs达90%以上;FACS结果显示:CSCs阳性率91.26%,表达CD45的CSCs为0.65%,表达CD34的CSCs仅为0.32%。Annexin V-PI FACS示:与normal组（总体凋亡率2.6%）相比,在100μmol/L H₂O₂处理2h时总体凋亡率达到95.86%（P<0.05）。4.采用Di I染色检测对BMSC-exosome进行Dil染色,采用免疫荧光观察CSC对BMSC-exosome的内化摄取情况。结果显示:在共培养24h时,被Di I染色的外泌体可被CSC完全内化吸收。5.采用CCK-8法检测不同浓度BMSC-exosome对CSCs细胞活性的影响,结果显示:BMSC-exosome作用浓度为400ng/μl时氧化应激状下C-kit⁺CSCs活性达到最大值（P<0.05）。6.将实验分为四组:（1）常氧对照组（normal组）（2）对照组（control组）（3）常氧外泌体组（N-exo组）（4）缺氧外泌体组（H-exo组）,行Annexin V-PI FACS检测细胞凋亡率,结果示:与normal组相比,control组的细胞凋亡率明显上升（P<0.05）;与control组相比,N-exo组和H-exo组均可抑制氧化应激状态下c-kit+CSCs总体凋亡率和早期凋亡率（P<0.05）,且H-exo组的抗凋亡作用更为显著（P<0.05）;此外,H-exo组可明显抑制c-kit+CSCs晚期凋亡率（P<0.05）。WB结果示:与normal组相比,control组凋亡相关蛋白caspase8、caspase9和cleaved-caspase3的蛋白水平表达明显上升（P<0.05）;与control组相比,H-exo组可明显抑制cleaved-caspase3、caspase8、caspase9蛋白表达（P<0.05）,而N-exo组则只可抑制cleaved-caspase3、caspase9蛋白表达（P<0.05）。激光共聚焦显微镜结果示:与control组相比,H-exo组和N-exo组均可明显抑制CSC内钙离子荧光强度（P<0.05）,且H-exo组抑制效果更为明显（P<0.05）。第二部分7.将实验分为三组:（1）normal组（2）control组（3）H-exo组。采用WB检测SERCA2a、PLB、Ry R2的蛋白水平表达。结果示:与normal组相比,control组和H-exo组SERCA2a和PLB蛋白水平表达均明显下降（P<0.05）,Ry R2蛋白水平表达明显上升（P<0.05）;与control组相比,H-exo组SERCA2a蛋白水平表达明显上升（P<0.05）,PLB和Ry R2蛋白水平表达明显下降（P<0.05）。8.采用RT-PCR检测N-exo组和H-exo组外泌体内micor RNA-133a m RNA的表达,结果示:与N-exo组相比,H-exo组内micor RNA-133a m RNA表达明显上升（P<0.05）。9.将实验分为四组:（1）normal组（2）control组（3）N-exo组（4）H-exo组。采用RT-PCR检测各组细胞内microRNA-133a m RNA表达水平,结果示:与normal组相比,control组micor RNA-133a m RNA表达水平明显上升（P<0.05）;与control组相比,H-exo组内micor RNA-133a m RNA表达水平明显上升（P<0.05）。10.实验分为六组:（1）Control组（2）H-exo组（3）mimic组（4）MNC组（5）inbihitor组（6）INC组。FACS结果示:与mimic组相比,control组早期凋亡率、晚期凋亡率和总体凋亡率明显上升（P<0.05）,H-exo组早期凋亡率、晚期凋亡率和总体凋亡率明显下降（P<0.05）;与inhibitor组相比,control组晚期凋亡率明显上升（P<0.05）,早期凋亡率和总体凋亡率明显下降（P<0.05）,H-exo组早期凋亡率明显上升（P<0.05）,晚期凋亡率和总体凋亡率明显下降（P<0.05）,坏死率明显减少（P<0.05）。WB结果示:与mimic组相比,H-exo组caspase8、cleaved-caspase3蛋白水平明显下降（P<0.05）,inhibitor组caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明显上升（P<0.05）;与inhibito组相比,H-exo组caspase8、caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平表达明显下降（P<0.05）,mimic组caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明显下降（P<0.05）。这表明,过表达microRNA-133a可明显抑制caspase9和cleaved-caspase3蛋白水平表达,但对caspase8蛋白水平影响不大。CLSM结果示:与mimic组相比,control组和H-exo组荧光强度明显上升（P<0.05）;与control组相比,H-exo组钙离子荧光强度明显下降（P<0.05）;与inhibitor组相比,H-exo组和mimic组钙离子荧光强度明显下降（P<0.05）,但与control组相比,H-exo组钙离子荧光强度情况仍存在明显差异（P<0.05）。11.针对各组PLB蛋白表达水平情况,WB结果示:与mimic组相比,control组PLB蛋白水平表达明显上升（P<0.05）,H-exo组表达明显下降（P<0.05）;与inhibitor组相比,H-exo组表达明显下降（P<0.05）。RT-PCR结果示,与mimic组相比,H-exo组PLB m RNA水平表达明显下降(P<0.05;与inhibitor组相比,H-exo组PLB m RNA水平表达明显下降。mimic组与inhibitor组PLB m RNA表达水平无明显差异（P>0.05）。对此,我们认为,microRNA-133a对于氧化应激状态下C-kit⁺CSCs的PLB调控可能仅限于蛋白水平。12.实验分为4组,即:（1）Control组（2）H-exo组（3）PLB si RNA组（4）SNC组。将PLB si RNA转染入C-kit⁺CSCs后,RT-PCR结果示:与PLB si RNA组相比,control组、H-exo组和SNC组PLB m RNA水平表达均明显上升（P<0.05）。WB结果示,与PLB si RNA组相比,control组、H-exo组和SNC组PLB蛋白水平表达均明显上升（P<0.05）。WB检测各凋亡蛋白,结果示:与PLB si RNA组相比,control组和SNC组caspase9和cleaved-caspase3蛋白表达水平明显上升（P<0.05）,而H-exo组caspase8、caspase9和cleaved-caspase3蛋白表达水平均明显下降（P<0.05）。本实验说明抑制PLB可能会导致cleaved-caspase3和caspase9蛋白表达水平下降,但对caspase8蛋白水平表达无明显调节效应。激光共聚焦显微镜结果示:与control组相比,si RNA组钙离子荧光强度程度明显下降（P<0.05）,说明PLB的差异性表达在H-exo对氧化应激状态下c-kit+CSCs钙稳态的调节中扮演着弥足轻重的作用。结论:1.缺氧预处理BMSC所分泌的exosome对氧化应激状态下的C-kit⁺CSCs更具有抗凋亡作用,其抗凋亡效应可能与其对钙稳态的调控效应有关;2.缺氧预处理BMSC-exosme可能通过microRNA-133a/PLB信号通路抑制氧化应激状态下的C-kit⁺CSCs钙稳态和凋亡。