副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属于巴斯德菌属的一种NAD依赖性细菌。主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。随着世界养猪业的发展,该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。作为一种新发的细菌传染病,由于对其研究起步较晚,人们对其毒力因子及致病机理知之甚少,严重制约着对该病的诊断与防控。目前仍没有系统的关于副猪嗜血杆菌蛋白组学研究的报道。取得的主要研究结果如下：1.副猪嗜血杆菌全菌表达图谱的构建我们首次运用2-DE系统结合MALDI-TOF MS技术构建了HPS 5型菌株SH0165的外膜、分泌和胞浆蛋白的全菌表达图谱。共成功鉴定539个蛋白点,提供317种蛋白。其中鉴定出一些重要的参与HPS生理过程的外膜蛋白,如Wza,Omp2,Omp5,D15和Pa1A等；此外一些毒力相关因子,如参与typeⅠ(To1C), typeⅡ(DsbA, DsbC)和typeⅤ(Autotransporter adhesins)分泌系统和参与离子摄取系统的蛋白也在本研究中被首次鉴定。HPS全菌2-DE表达图谱的建立为副猪嗜血杆菌致病机理的阐明及攻克提供理论依据和解决途径,并能有效的补充基因组的注释。2.副猪嗜血杆菌新型免疫外膜蛋白筛选与鉴定为开发更加有效和安全的疫苗控制HPS感染,我们运用免疫蛋白质组学和反向疫苗学方法分析HPS外膜蛋白。其中免疫蛋白质组学方法共鉴定15个免疫外膜蛋白。我们选取其中8个候选免疫蛋白进行深入研究,研究结果说明：(1)其中6个蛋白的抗体能在康复血清和免疫血清中检测到,说明这6个蛋白在HPS感染过程中是体内表达的；(2)5个蛋白的抗血清在补体存在的情况下可以通过调理吞噬作用有效地抑制细菌生长；(3)4个蛋白在小鼠攻毒试验中提供较好的保护力。因此,我们结果说明Pa1A,Omp2, D15和HPS 06257 4个蛋白具有发展新型疫苗的潜力。运用反向疫苗学方法鉴定出HSP60和HbpB2个免疫原性蛋白,可以诱导明显的混合抗体(IgGl和IgG2a)应答,HSP60和HbpB的高免血清具有明显的调理吞噬活性和在被动免疫试验中提供一定保护力；此外HSP60和HbpB在小鼠攻毒试验中分别提供70%和90%保护率。副猪嗜血杆菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学和反向疫苗学研究有利于开发HPS新型疫苗和诊断标记。3.副猪嗜血杆菌细胞膨胀毒素(Cdts)致病机理及免疫研究我们首次鉴定副猪嗜血杆菌5型的基因组中编码2个Cdts毒素家族,每个Cdts由CdtA, CdtB和CdtC 3个亚单位组成。单独CdtB可以诱导细胞周期抑制,CdtA和CdtC明显促进CdtB诱导细胞周期G2期抑制的能力。Cdt各亚单位可以相互作用形成一个有活性的全毒素诱导最大毒性作用。细胞膜结合试验表明,在PAM细胞中CdtA, CdtB和CdtC都可以与细胞膜结合；而在Hep-2/Hela细胞中,CdtA和CdtC可以与细胞膜结合,但CdtB不能与细胞膜结合。在2种细胞中,CdtA与细胞膜的结合能力最强,并且Cdts结合细胞膜的能力主要依赖于细胞质膜上的胆固醇。此外我们在CdtC中鉴定出一个非典型的CRAC结合位点,CRAC结合位点77位氨基酸的突变导致Cdts毒性活性的降低。免疫印迹结果显示15个HPS标准血清型和临床分离株中都表达CdtB亚单位和呈现细胞毒性,说明Cdts是HPS一个非常保守的毒力相关因子。最后我们评价了Cdts在免疫学方面的作用,结果显示处理得到的Cdts类毒素可以诱导较高的ELISA抗体和中和抗体,Cdts类毒素还可以诱导IL-2,IL-4和IFN-r细胞因子分泌,而且并且在小鼠攻毒中提供一定的保护力,具有发展为疫苗有效成分的潜力。