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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的病毒性疾病。猪肺泡巨噬细胞(PAM)是PRRSV感染的主要靶细胞,是主要的抗原递呈细胞。本文用PRRSVHB-2(sh)/2002经体外和体内感染PAM,通过分析PAM内源性抗原加工递呈相关分子的mRNA转录动态和PAM表面MHCI类分子的表达变化,从分子和基因水平揭示了PRRSV感染对PAM内源性抗原加工递呈功能的影响。
用RT-PCR技术从PAM中扩增和克隆了与内源性抗原加工递呈相关分子LMP7、UBP、Hsp70、Hsp90、MHCclassI、β2-microglobulin、GRP94/gp96,calnexin的部分基因片段,经测序鉴定后,应用倍比稀释的高纯度质粒,利用实时荧光定量PCR技术构建出各相关分子的标准定量曲线和直线回归方程。
用实时荧光定量PCR技术分析了PRRSV体外感染PAM的内源性抗原加工递呈相关分子mRNA的转录动态。结果表明,体外感染后UBPmRNA转录水平在48h内一直处于上调状态;LMP7、Hsp70、Hsp90、MHCclassI、β2-microglobulin、GRP94/gp96,calnexin的mRNA转录水平均在感染后12h至48h之间被抑制,由此推测PRRSV感染肺泡巨噬细胞的内源性抗原加工和递呈功能受到抑制。
用PRRSV感染30头仔猪后,采用实时荧光定量PCR技术分析了不同时相PAM的内源性抗原加工递呈相关分子的mRNA转录动态。结果表明,PRRSV感染后PAM的UBP和Hsp90mRNA转录水平在42天内一直处于上调状态;LMP7、Hsp70的mRNA转录水平在感染后一直处于下调状态;MHCclassI、β2-microglobulin、GRP94/gp96的mRNA转录水平均在感染后3天被上调,7天和14天时均被下调,低于对照且差异显著,在28天时上调,MHCclassⅠ的mRNA水平在28天时与对照没有差异,β2-microglobulin、GRP94/gp96在42天时转录水平恢复到正常水平;calnexin在感染3天时显著上调,42天时恢复至正常水平。用流式细胞术分析了PAM表面MHCI类分子的表达动态,结果表明,PRRSV感染后3天,感染组PAM表面的MHCI类分子表达增强,随后下调,7天后其表达水平一直低于对照组,在28天时差异显著。由此说明,PRRSV感染使猪肺泡巨噬细内源性抗原加工和递呈在感染早期受到严重抑制,后期有所恢复,但未达到正常水平,提示PRRSV感染可导致PAM的内源性抗原加工和递呈能力下降,而使机体特异性细胞免疫应答受到抑制,从而造成PRRSV在感染猪PAM中长期存在,引起持续性感染。